Ихилов Израиль Ichilov
Топ Ихилов
Официальный сайт
Израиль, Тель-Авив, ул. Вайцман 14
Тель-Авив: +972-3-7621629 Москва: +7-495-7773802 Прошу перезвонить

Позвонить в Топ Ихилов

Инновационная иммунотерапия от израильских учёных смогла уничтожить раковые клетки в головном мозге

Израильские учёные разработали новый метод иммунотерапии рака головного мозга.

Исследователи из Тель-Авивского университета, МЦ Ихилов и Научного Института Вейцмана в сотруднчестве с зарубежными коллегами разработали уникальный метод иммунотерапии рака, в основе которого лежит генная инженерия. Метод позволяет улучшить функцию Т-клеток в борьбе с раковыми клетками. Разработка способна помочь пациентам с раком головного мозга, в частности глиобластомой. Исследование под названием «P32-специфические CAR-T-клетки с двойным противоопухолевым и антиангиогенным потенциалом в лечении глиом» недавно было опубликовано в престижном журнале Nature Communications.

Авторы исследования: Лиат Руссо-Нури, Игнасио Мастандреа, Шаули Талмор (факультте нейробиологии, биохимиии и биофизики, Тель-Авивский университет, Израиль), Тома Вакс (департамент иммунологии, Научный Институт Вейцмана, Израиль), Анат Глоберсон Левин (медицинский центр Ихилов, Израиль), Марджа Хаугас (Институт биомедицины, университет Тарту, Эстония), Тамбет Теесалу (Центр наномедицины, университет Санта-Барбары, Калифорния, США), Луис Альварес-Валлина (департамент иммунотерапии рака, университетская клиника 12 октября, Испания), Зелиг Эшхар (медицинский факультет им. Саклера, Тель-Авивский университет, Израиль), Динора Фридман-Морвински (Школа нейрохирургии Sagol, Тель-Авивский университет, Израиль).

Введение

Злокачественные глиомы головного мозга – это наиболее часто встречающиеся опухоли центральной нервной системы. Они отличаются высокими инфильтративными свойствами и очень неблагоприятным прогнозом. Глиобластома – это самая агрессивная и летальная форма злокачественной глиомы. При глиобластоме средние показатели выживаемости составляют 12-18 месяцев. Текущий стандарт лечения впервые диагностированной глиобластомы включает максимальную хирургическую резекцию, лучевую терапию и параллельную химиотерапию (темозоломид). К сожалению, эта линия терапии обладает ограниченной эффективностью, и заболевание прогрессирует или рецидивирует. Эффективных методов лечения рецидивировавшей глиобластомы не существует.

В последние десять лет в центре внимания находится противоопухолевая иммунотерапия, основанная на адоптивном переносе клеток и блокировании контрольных точек. Она позволила достичь внушительных успехов в клинической работе. Химерные антигенные рецепторы (CAR) обладают способностью как распознавать опухолевые клетки подобно антителам, так и активировать T-лимфоциты. Благодаря этому они наделяют модифицированные T-лимфоциты способностью распознавать и уничтожать клетки раковой опухоли. CAR-T-клеточная терапия, воздействующая на рецептор CD19 у пациентов с онкологическими заболеваниями крови (гемобластозами), обеспечила значительный успех, однако при первоначальных попытках применить такой же подход в лечении солидных опухолей эксперты столкнулись с рядом затруднений.

Одна из проблем в отношении солидных опухолей – нехватка достаточных и специфических мишеней, которые способствовали бы разработке CAR-T-клеток с потенциалом и опасной токсичностью для мишеней, а не собственно для опухоли. Проблемы CAR-T-клеточной терапии при глиобластоме освещаются в трех опубликованных научных исследованиях. В качестве антигенов-мишеней в этих исследованиях применялись рецептор эпидермального фактора роста III (EGFRvIII), рецептор-2 человеческого эпидермального фактора роста (HER2) и рецептор интерлейкина 13Rα2 (ИЛ-13Rα2). Несмотря на то, что во всех трех исследованиях представлены доказательства специфического уничтожения опухолевых клеток, экспрессирующих перечисленные антигены, в клинических испытаниях наблюдался ограниченный противоопухолевый ответ, и все пациенты со временем умерли от рака.

Ранее мы сообщали об успешном лечении преклинических моделей глиобластомы наносистемой, направленной на сосудистую сеть опухоли. Эта система состоит из наночастиц, покрытых пептидом CGKRK. Пептид наводит частицы на опухоль и обеспечивает прицельную доставку груза к опухолевым клеткам и клеткам опухолевого эндотелия при глиобластоме. Мы установили, что p32/gC1qR/HABP/C1qBP – это рецептор пептида CGKRK, экспрессируемый в большом объеме на поверхности опухолевых клеток и клеток опухоль-ассоциированного эндотелия. P32, также известный как компонент комплемента 1, Q-субкомпонент-связывающий белок (C1QBP), преимущественно локализуется в митохондриальном матриксе, где поддерживает окислительное фосфорилирование и регулирует синтез генов, кодируемых митохондриальной ДНК.

В представленном исследовании мы обосновываем экспрессию p32 в злокачественных глиомах и подтверждаем, что он экспрессируется на поверхности опухолевых клеток. Затем мы сосредоточиваемся на разработке CAR, который воздействовал бы на p32-положительные клетки глиомы и принципиально подтверждал предположение о том, что p32-CAR-T-лимфоциты способны распознавать и уничтожать не только клетки глиомы, но и клетки опухолевого эндотелия. Мы демонстрируем, что лечение p32-CAR-T-клетками уменьшает васкуляризацию опухоли и продлевает общую выживаемость мышей с глиомами. Согласно нашим данным, p32 является опухоль-ассоциированным антигеном (ОАА) в глиомах, и потому CAR-T-клеточная иммунотерапия против этой мишени позволяет добиться положительных результатов в борьбе как с собственно опухолью, так и с ее ангиогенезом.

Ход исследования

P32 экспрессируется в мышиных и человеческих глиомах

Другие авторы и мы идентифицировали p32 как рецептор трех таргетных наночастиц, покрытых пептидами, нацеленными на опухоль: Lyp-1, CGKRK и LinTT1. В раковых опухолях человека в сравнении с нормальной тканью наблюдается существенная ап-регуляция p32, и несмотря на его преимущественную экспрессию в митохондриях, несколько исследовательских групп указали на экспрессию p32 на поверхности злокачественных клеток. Мы попытались установить профиль экспрессии p32 в мышиных и человеческих глиомах. Используя массивы данных «Rembrandt», мы вначале подтвердили ап-регуляцию мРНК p32 в низко- и высокозлокачественных глиомах в сравнении с неопухолевой тканью, во всех трех молекулярных подтипах глиобластомы. Мы использовали когорту спаренных образцов первичной и рецидивировавшей глиобластомы и обнаружили повышенные уровни мРНК p32 в рецидивирующих глиобластомах.

Анализ выживаемости по методу Каплана-Мейера указал на то, что повышенная экспрессия p32 в злокачественных глиомах связана с наиболее неблагоприятным прогнозом и снижением показателей общей выживаемости. Далее мы окрасили образцы человеческой глиомы антителом к p32, обнаружили существенное повышение экспрессии в соответствии с повышением степени злокачественности опухоли и сравнили полученные показатели с нормальной тканью головного мозга. Схожие результаты отмечались и ранее, при оценке экспрессии p32 с использованием монослоя ткани головного мозга: в высокозлокачественных глиомах наблюдалась гораздо более значительная ап-регуляция p32 по сравнению с нормальными тканями мозга. Мы проверили экспрессию белка p32 методом вестерн-блоттинга клеток мышиной глиобластомы, стволовых клеток глиомы GBM83 пациентов и прижившихся клеток человеческой глиомы, а также методом конфокальной микроскопии в изогенных и ксенотрансплантатных мышиных моделях, и тем самым подтвердили специфическую экспрессию в опухолях, но не в здоровых тканях головного мозга.

Наконец, мы изучили экспрессию p32 на поверхности нескольких клеток мышиной глиомы, взятых из мышиных моделей с лентивирус-индуцированными взрослыми и детскими глиомами (005, AFFR53 и O1), а также на вживленных человеческих клеточных линиях (87, U118, U178 и U251) и стволовых клетках глиомы, взятых у пациентов (PD-GSCs). Анализ проводился методом проточной цитометрии. Среди стволовых клеток глиомы пациентов имеются представители как проневрального (GBM1079 и GBM1051), так и мезенхимального (GBM83, GBM1005, GBM1027) молекулярного подтипа глиобластомы. После окрашивания все клетки глиомы дали положительный результат на экспрессию p32 на клеточной поверхности с применением того же анти-p32 моноклонального антитела, в то время как первичные человеческие клетки дали отрицательный результат.

Кроме того, мы изучили интрацитоплазматическую и поверхностную экспрессию p32 в клетках мышиной глиомы и клетках человеческой глиомы в сравнении с первичными астроцитами и фибробластами коры головного мозга и снова получили подтверждение того, что поверхностная экспрессия происходит только в опухолевых клетках. В совокупности эти данные указывают на то, что p32 может служить опухоль-ассоциированным антигеном в терапии низко- и высокозлокачественных глиом.

Разработка и характеристики мышиных и человеческих p32-специфических CAR-T-клеток

Чтобы выяснить, может ли p32, экспрессируемый на поверхности клеток глиомы, служить альтернативным опухоль-ассоциированным антигеном в целях адоптивной клеточной иммунотерапии опухолей головного мозга, мы разработали p32-специфический CAR-конструкт второго поколения. В целях получения p32-CAR мы клонировали одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), клон 2.15, направленный на тот же C1q-связывающий домен p32, что и клон антитела 60.11, использованный во всех экспериментах с окрашиванием, описанных в предыдущем разделе.

P32 – это высококонсервативный белок; и антитело, и клон scFv 2.15 распознают человеческий и мышиный p32. За scFv следуют трансмембранный и цитоплазматический CD28 и внутриклеточные домены FcyR, способные активировать и мышиные, и человеческие T-клетки. Мы добавили метку FLAG к члену N scFv для того, чтобы облегчить валидацию экспрессии CAR-конструкта на поверхности трансдуцированных T-клеток, и флуоресцентный репортер Mcherry (отделенный от CAR-кассеты пропущенной последовательностью P2A) для того, чтобы оценить эффективность трансдукции.

Эффективность трансдукции и мышиных, и человеческих активированных T-клеток с применением одинакового CAR-конструкта в среднем составила 30-40%. По результатам фенотипического анализа субпопуляций CD4 и CD8 нам не удалось выявить существенных изменений в их процентном соотношении после трансдукции CAR-экспрессирующими ретровирусными частицами. При этом субпопуляции CD4 и CD8 экспрессировали p32-CAR. По неразличимым уровням активации T-клеток между контрольными моделями и CAR+-T-клетками и отсутствию различий в экспрессии маркеров истощения можно предположить, что введение CAR в T-клетки не привело к тонической передаче сигнала. По результатам фенотипического анализа человеческих лимфоцитов выяснилось, что p32-CAR+-T-клетки обладают центральной памятью, эффекторной памятью и памятью стволовых T-клеток, причем существенной разницы между нетрансдуцированными и CAR+-экспрессирующими T-клетками не обнаружилось.

Функциональное исследование p32-CAR-T-клеток in vitro

Далее мы оценили противоопухолевый эффект мышиных и человеческих p32-CAR-T-клеток in vitro. Чтобы изучить функциональность мышиных p32-CAR-T-клеток, мы использовали две разные линии p32-положительных опухолевых клеток: клетки дифференцированном состоянии (AFFR53) и стволовые клетки глиомы (005, GSC), формирующие типичные нейросферы, или опухолевые сферы. В целях более подробного изучения специфичности p32-mCAR-T-клеток мы произвели нокдаун экспрессии p32 в этих клетках. Все указанные линии опухолевых клеток кокультивировались с контрольными анти-TNP-SP6- mCAR-T- или p32-mCAR-T-клетками при разных соотношениях эффекторных T-клеток к опухолевым клеткам.

Перенаправленные p32-mCAR-T-клетки эффективно и специфически уничтожали p32+-экспрессирующие клетки глиомы, причем при кокультивировании с p32KD-клетками эффекта не наблюдалось. Нерелевантные контрольные SP6-mCAR-T-клетки не продемонстрировали цитотоксической активности при кокультивировании с клетками всех глиом. Специфическая цитотоксическая активность и экспансия CAR+-T-клеток получили дополнительное подтверждение по результатам кокультивирования SP6 и p32-mCAR-T-клеток с GFP-положительными клетками глиомы и анализа методом проточной цитометрии. Пролиферацию T-клеток в ответ на p32-положительные таргетные клетки глиомы мы оценили методом разведения с использованием красителя CellTracer Violet. Далее мы оценили опухоль-специфическое распознавание p32-экспрессирующих клеток глиомы через интрацитоплазматическую выработку интерферона-гамма и секрецию в питательную среду.

Мы провели аналогичные эксперименты с трансдуцированными человеческими p32-CAR-T-клетками после кокультивирования их либо с клетками человеческой глиомы U87 (содержащимися с сывороткой, в дифференцированном состоянии), либо со стволовыми клетками глиомы, полученными от пациентов (GBM83). В качестве контрольных моделей во всех экспериментах с клетками человеческой глиомы использовались нетрансдуцированные T-клетки. В то время как p32-hCAR-T-клетки производили цитотоксический эффект, пролиферировали и секретировали интерферон-гамма при кокультивировании с клетками глиомы, нетрансдуцированные T-клетки почти не реагировали на опухолевые клетки. По этим результатам видно, что и мышиные, и человеческие p32-CAR-T-клетки специфически распознают p32-положительные таргетные клетки глиомы и уничтожают только те опухолевые клетки, которые экспрессируют p32.

P32-CAR-T-клетки демонстрируют противоопухолевую активность и в изогенных, и в ксенотрансплантатных моделях

Чтобы оценить противоопухолевый эффект p32-mCAR-T-клеток на изогенную иммунокомпетентную модель in vivo, мы трансплантировали клетки 005 в головной мозг мышей C57BL/6. Девять дней спустя мыши подверглись прекондиционированию с применением единственной дозы 200 мг/кг циклофосфамида интраперитонеально, в целях лимфодеплеции и облегчения адоптивного трансфера модифицированных лимфоцитов. На 10 день мы произвели инфузию суммарно 1×107 T-клеток, содержащую ~4×106 p32-специфических mCAR+-T- или Sp6-специфических mCAR+-T-клеток (контрольная группа) внутривенно (инъекция в хвостовую вену). Через семь дней мы произвели вторую инфузию, введя каждой мыши еще одну дозу 1×107 (4×106 mCAR+) T-клеток.

Судя по результатам, мыши, получившие p32-mCAR-T-клетки, прожили дольше контрольной группы (средняя выживаемость 71 против 43 дней, p=0,0413, соответственно), причем до конца эксперимента опухоль так и не удалось обнаружить у 30% обработанных мышей. У мышей, получивших инфузию p32-mCAR-T-клеток, не наблюдалось связанных с этим токсических или нежелательных эффектов, что указывает на специфичность и безопасность таких CAR-T-клеток in vivo.

С целью дальнейшего изучения потенциальной токсичности p32-mCAR-T-клеток мы произвели прекондиционирование мышей C57BL/6 J, не являющихся носителями опухолей, и через 24 часа ввели им внутривенно либо SP6-, либо p32-mCAR-T-клетки. Все мыши были умерщвлены 2 недели спустя с целью оценки органной токсичности. В исследуемых секциях ткани мы не обнаружили никаких признаков явного поражения или воспаления. Далее мы произвели сбор легочной ткани, которую расслоили и проанализировали на предмет пролиферации и активации CAR-T. И снова мы не обнаружили различий между нерелевантными CAR и p32-специфическими CAR-T-клетками, что указывает на отсутствие побочного действия, так как активированное состояние введенных CAR-T-клеток в здоровых тканях, включая легочные, не изменилось.

Далее мы протестировали человеческие трансдуцированные CAR-T-клетки в двух человеческих ортотопических ксенотрансплантатных моделях. Вначале мы трансплантировали клетки U87 в головной мозг мышей NUDE, широко используемых преклинических воспроизводимых ксенотрансплантатных моделей глиобластомы. Через десять дней после внутричерепной инъекции клеток глиомы U87 мы произвели внутриопухолевую инфузию p32-hCAR-T-клеток или UT-клеток. График выживаемости по методу Каплана-Мейера демонстрирует существенное улучшение показателей общей выживаемости мышей, получивших p32-hCAR-T-клетки в сравнении с контрольной группой.

В следующей серии экспериментов мы решили использовать более агрессивную модель глиобластомы, на этот раз со стволовыми клетками глиомы пациентов (GBM83), извлеченными из агрессивной мезенхимальной опухоли. Вначале мы произвели трансдукцию клеток GBM83 с люциферазой светляка, позволяющей отслеживать рост опухоли методом биолюминесцентной визуализации in vivo, и затем ортотопически трансплантировали клетки мышам NUDE. Латентность опухолей GBM83 в среднем составляет 20 дней, поэтому через три дня после инъекции опухолевых клеток (наличие новообразования подтверждалось положительным сигналом люциферазы) мыши получили одну дозу (1×107 клеток) UT- или p32-hCAR-T-клеток (содержащую ~4×106 hCAR+-T-клеток) в виде внутриопухолевой инъекции и еще одну дозу в виде внутрижелудочковой инъекции (суммарно 2,5×106 T-клеток, ~1×106 CAR+). Последний способ введения мы выбрали на основании положительных и улучшенных результатов преклинических и клинических испытаний CAR-T-клеток при глиобластоме.

В то время как у UT-контрольных мышей наблюдался продолжительный рост опухоли и быстрое наступление смерти, у мышей, получивших p32-hCAR-T-клетки, отмечалась более длительная выживаемость. Токсичности или нежелательных эффектов не обнаружилось. После сравнения данных, полученных по результатам биолюминесцентной визуализации, мы выявили существенные различия между 6-м и 17-м днями лечения у UT- и p32-hCAR-T-групп. Одним из проявлений прицельного действия стало снижение антигенной экспрессии в оставшейся опухоли после лечения.

В этой связи в конце эксперимента мы проанализировали получившиеся опухоли после лечения p32-hCAR-T- и UT-клетками и сравнили показатели их экспрессии p32 методом иммунофлуоресцентной конфокальной микроскопии и проточной цитометрии. Мы обнаружили, что у мышей, получивших p32-hCAR-T-клетки, уровни экспрессии p32 снизились в сравнении с UT-контрольными мышами. Далее мы решили проанализировать экспрессию PD-1 на CD3+-инфильтрирующих T-клетках, дающих сигналы выше порогового значения, в группах опухолей UT и p32-hCAR-T, и выяснили, что во всех обработанных образцах отмечаются высокие уровни экспрессии PD-1. На основании этих результатов и уже опубликованных исследований, посвященных CAR-T-терапии, мы можем предположить, что T-клетки в опухолях истощаются и, вероятно, попадают под влияние иммуносупрессивной микросреды глиомы.

Антиангиогенный эффект p32-CAR-T-клеток

Когда мы впервые идентифицировали p32 в качестве рецептора наносистемы, покрытой пептидом CGKRK, мы обнаружили, что он экспрессируется не только на поверхности клеток глиомы (например, 005 GSCs), но и в эндотелиальных клетках опухоли (TDEC), а также в ее сосудистой сети. В условиях гипоксии стволовые клетки глиомы 005 способны к трансдифференциации и выработке TDEC как in vitro, так и in vivo. По результатам конфокальной микроскопии и анализа методом FACS нам удалось подтвердить экспрессию p32 в клетках 005, культивированных в эндотелиальной среде EGM2, с добавлением дефероксамина (DFO), хелатора железа, имитирующего условия гипоксии за счет блокирования пролин-гидроксилазы.

Далее мы кокультивировали p32- или SP6-mCAR-T-клетки с 005 TDEC с разными соотношениями эффектор-мишень и выяснили, что p32-mCAR-T-клетки эффективно уничтожают p32-экспрессирующие TDEC. Цитотоксическое действие p32-mCAR-T-клеток подкреплялось выбросом интерферона-гамма в супернатанте клеточной культуры. Что примечательно, во время анализа опухолевых срезов в предыдущих экспериментах in vivo с применением метода конфокальной микроскопии мы обнаружили, что несмотря на обширную васкуляризацию и положительный результат окрашивания на эндотелиальный маркер vWF в опухолях контрольных групп, получивших UT или контрольные SP6-CAR-T-клетки, в опухолях мышей, получивших p32-CAR-T-клетки, отмечалось наличие гораздо меньшего количества кровеносных сосудов. Та же тенденция наблюдалась и при инфузии опухолей GBM83 UT- либо p32-CAR-T-клетками, когда мы произвели рассечение опухолей в конце эксперимента и проанализировали их на CD31+ методом проточной цитометрии.

Чтобы подтвердить, что данный антиангиогенный эффект связан с экспрессией p32 на TDEC и сосудистой сети опухоли, мы модифицировали клетки GBM83 таким образом, чтобы они избыточно экспрессировали ErbB2. Затем мы произвели трансдукцию T-клеток ErbB-2-специфическим CAR (hN29) и оценили воздействие hN29-CAR-T на клетки ErbB-2-GBM83 in vitro. Наконец, мы произвели инфузию UT или hN29-CAR-T (с той же дозировкой и локализацией, что и в экспериментах с hp32-CAR-T) мышам, получившим инъекцию ErbB-2-GBM83, и отследили рост опухоли и выживаемость мышей. В то время, пока мы наблюдали за воздействием hN29-CAR-T-клеточной терапии на рост опухоли и выживаемость мышей, изменений в сосудистой сети опухоли не произошло. В совокупности наши результаты указывают на то, что p32-CAR-T-клетки способны распознавать не только опухолевые, но и опухоль-ассоциированные эндотелиальные клетки, что позволяет предположить, что p32-CAR-T-клетки обладают антиангиогенным эффектом и воздействуют на сосудистую сеть опухоли.

Результаты

Несмотря на текущий успех CAR-T-клеточной терапии в лечении CD19+-B-клеточных лимфом, на пути прогресса в борьбе с солидными опухолями все еще стоят многочисленные препятствия. В число таких признанных проблем входит выявление подходящего неоантигена или опухоль-ассоциированного антигена с целью перенаправления модифицированных CAR-T-клеток. Для глиобластомы, как и для других солидных опухолей, характерна высокая биологическая сложность с акцентом на молекулярную и клеточную гетерогенность, отраженную в спектре динамических клеточных состояний. Доказано, что моноспецифическая CAR-T-клеточная терапия является целесообразным и безопасным способом лечения глиобластомы, однако со временем она приводит к росту опухоли без экспрессии единственного таргетного антигена. Таким образом, для обеспечения стратегического успеха CAR-T-клеточной терапии в лечении таких гетерогенных солидных опухолей, как глиобластома, необходимо идентифицировать ряд антигенов, ассоциированных с глиомой.

В предыдущем исследовании мы обнаружили, что при глиобластоме p32 является связывающим партнером наночастиц, покрытых пептидами CGKRK и LinTT1, нацеленными на опухоль. В представленной работе мы подтвердили и обосновали ап-регуляцию и поверхностную экспрессию p32 в клетках глиомы и ассоциированных эндотелиальных клетках. Важнее всего то, что нам не удалось выявить экспрессию p32 в нормальной ткани головного мозга или здоровых тканях других внутренних органов.

Известно, что повышенная экспрессия p32 наблюдается при различных злокачественных опухолях, включая меланому, рак кишечника, рак яичников, эндометриальный рак, рак простаты и рак молочной железы, что свидетельствует о его потенциальной роли в опухолегенезе. И действительно: генетический нокдаун p32 изменил метаболизм опухолевых клеток с окислительного фосфорилирования на гликолиз и замедлил образование опухоли in vivo. Экспрессия p32 при глиоме тесно взаимосвязана с экспрессией c-myc и вовлечена в репрограммирование метаболизма глутамина в этих опухолях. Сайленсинг p32 вызвал нарушение пролиферации таких клеток in vitro и произвел противоопухолевый эффект in vivo.

С учетом этих данных p32 в митохондриях начал рассматриваться исследователями в качестве терапевтического средства против глиомы и использоваться с ингибитором малых молекул. Несмотря на то, что эксперты уже исследовали функциональную роль митохондриального p32, механизм его транслокации на клеточную поверхность до сих пор не изучался достаточно подробно. Известно, что p32 является белком, связывающим гиалуроновую кислоту (HABP). Гиалуроновая кислота (ГК) – это важный компонент внеклеточного матрикса (ВКМ) головного мозга и один из основных компонентов ВКМ глиобластомы. В дополнение к анатомическим и физическим аспектам на биологию опухоли влияют такие компоненты ВКМ, как тенасцин C, фибронектин и гиалуронан. От них зависят различные аспекты биологии глиобластомы (например, инвазивность, пролиферация, ангиогенез).

Основываясь на результатах недавно проведенного исследования, мы предполагаем, что повышенные уровни гиалуроновой кислоты нарушают нормальную локализацию p32 в митохондриях и индуцируют его транслокацию на клеточную поверхность. P32, экспрессируемый на поверхности опухолевых клеток, способен взаимодействовать с гиалуроновой кислотой. Это взаимодействие, в свою очередь, может способствовать высокой инвазивности и пролиферации клеток глиобластомы.

В представленной работе мы воспользовались выборочной экспрессией p32 на поверхности клеток глиомы и описали разработку и характеристики p32-специфических CAR-T-клеток, эффективно уничтожающих клетки глиомы как в дифференцированном состоянии, так и в виде стволовых клеток. Ранее исследователи предположили, что пластичность раковых клеток может являться альтернативным механизмом обеспечения клеточного многообразия и фактором, способствующим внутриопухолевой гетерогенности. Пластичность в солидных опухолях связывалась с эпителиально-мезенхимальным переходом; при глиобластоме она обеспечивает возможность перехода из дифференцированного состояния в недифференцированное, характерное для стволовых клеток.

Мы также сообщили о другом интересном сценарии в отношении пластичности раковых клеток – о трансдифференциации клеток глиомы в TDEC, демонстрирующей сложность этого феномена в опухолях головного мозга. Мы обнаружили, что p32 экспрессируется на поверхности дифференцированных клеток, GSCs и TDEC. Результаты наших исследований in vitro указывают на способность p32-CAR-T-клеток специфически распознавать и эффективно уничтожать все популяции клеток глиомы вне зависимости от фенотипа или дифференциации.

Известно, что стволовые клетки глиомы более устойчивы к стандартному лечению, включая химиотерапию и лучевую терапию, и некоторые исследователи даже полагают, что именно эта устойчивость предрасполагает к рецидиву глиобластомы. Кроме того, ранее мы продемонстрировали, что дифференциация GSC в TDEC не зависит от VEGF и FGF, из чего можно сделать вывод о том, что участие TDEC в опухолевом ангиогенезе может представлять собой один из механизмов резистентности к анти-VEGF терапии. Способность p32-CAR-T-клеток распознавать и уничтожать клетки глиомы в различных фенотипических/дифференцированных состояниях дает этой стратегии преимущество перед существующими методами стандартной терапии и обеспечивает возможность комбинирования различных терапевтических подходов в лечении глиобластомы.

В дополнение к разнородности внутри опухоли (внутриопухолевой гетерогенности) результаты генетического профилирования образцов глиобластомы, взятых у разных пациентов, помогли обнаружить межопухолевую гетерогенность, свидетельствующую о существовании по меньшей мере трех молекулярных подтипов глиобластомы: проневрального, классического и мезенхимального. Эти молекулярные подтипы могут в том числе сосуществовать внутри одной опухоли (пространственная гетерогенность) или меняться по мере прогрессирования опухоли или под воздействием терапии (временная гетерогенность).

И анализ Атласа ракового генома, и эксперименты на основе проточной цитометрии с использованием мезенхимальных и проневральных стволовых клеток глиомы продемонстрировали, что экспрессия p32 наблюдается во всех подтипах глиобластомы. В совокупности экспрессия p32 обнаруживается в низко- и высокозлокачественных глиомах, в разных клеточных состояниях и в разных подтипах глиобластомы, что делает ее глиома-релевантной мишенью для иммунотерапии. Но даже при наличии всех этих положительных характеристик, указывающих на то, что p32 является подходящим опухоль-ассоциированным антигеном для лечения глиом, и при существенном повышении показателей выживаемости наших преклинических моделей мыши с глиобластомами рано или поздно умирают от рака головного мозга.

Во всех экспериментальных моделях in vivo p32-CAR-T-клетки индуцировали регрессию роста глиобластомы, и необходимо отметить, что данный эффект оценивался на эндогенных уровнях экспрессии p32: трансплантированные клетки глиомы не подвергались сверхэкспрессии или модификациям in vivo. Положительным проявлением прицельного воздействия по сравнению с UT-группой послужило снижение антигенной экспрессии в опухолях, получивших p32-CAR-T-клетки. Токсичности после локального или системного введения p32-специфических CAR-T-клеток не наблюдалось. Мы полагаем, что в связи со значительной гетерогенностью в солидных опухолях необходимо воздействовать более, чем на один опухолевый антиген, используя, например, такие технологии, как CART-BiTE, уже получившую освещение в рамках лечения глиобластомы, или конвертируемые CAR, позволяющие одновременно или последовательно воздействовать на множественные антигены. В данном контексте преимущество p32 как антигена, поверхностно экспрессируемого опухолью, но не здоровыми тканями, добавляет еще один вариант в ограниченный спектр тех антигенов глиобластомы, на которые можно воздействовать CAR-T-клетками.

Как уже было указано в недавнем обзоре, одной из основных проблем CAR-T-клеточной терапии при глиобластоме остается внутри-/межопухолевая гетерогенность и потеря антигенов. Степень экспрессии каждого из антигенов, протестированных в вышеупомянутых клинических испытаниях CAR-T-клеток при глиобластоме, определялась не только регионарной и временной гетерогенностью, но и различиями среди пациентов. И, несмотря на успешное уничтожение клеток, ассоциированных с опухолевым антигеном, в каждом из клинических испытаний, исследователи также наблюдали прогрессирование клеток глиомы, не экспрессирующих релевантный антиген. Расширение спектра таргетных опухоль-ассоциированных антигенов и репертуара модифицированных CAR-T-клеток отчасти поможет преодолеть это препятствие в борьбе с глиобластомой.

Более того: несмотря на небольшое окно CAR-специфической активности (роста опухоли по результатам биолюминесцентной визуализации), мультифакторный иммуносупрессивный ответ in situ способствует экспрессии таких маркеров истощения, как PD-1, на инфильтрирующих T-клетках и возобновляет рост опухоли. Судя по нашим наблюдениям, адоптивный трансфер CAR-T-клеток можно комбинировать с ингибированием таких контрольных точек иммунного ответа, как ось PD1/PD-L1.

В заключение, в данной работе мы представили доказательства специфической поверхностной экспрессии p32 в глиомах и описали мощную противоопухолевую и антиангиогенную активность p32-специфических CAR-T-клеток против глиом и опухоль-ассоциированных и эндотелиальных клеток, свидетельствующую об их потенциальной полезности в лечении пациентов с глиомами.

Другие актуальные исследования:

Дата публикации: 10.07.2021
Работаем без выходных: 24/7
Обслуживание на трех языках: иврит, русский и английский
Введите ваши данные и врач клиники перезвонит вам в течение часа
Whatsapp
с врачом клиники 24/7
×
×
×
×