Израильские учёные разработали технологию восстановления костей с применением искусственно выращенных тканей

Израильские ученые разработали технологию восстановления костей с применением искуств

Уникальная технология, разработанная учёными университета Технион, позволяет выращивать костную ткань, содержащую кровеносные сосуды, в лабораторных условиях. Такая ткань быстро приживается в организме и способствует скорейшему восстановлению.

Авторы исследования: Идан Реденски, Шаовей Гуо, Маджд Мачур, Ариэль Шкланни, Шира Ландау, Бен Каплан (Израильский технологический институт Технион), Роберта И. Лок (Колумбийский университет, США), Янкель Габет (Тель-Авивский университет), Дана Эгози (Еврейский университет), Гордана Вунджак-Новакович (Колумбийский университет, США), Шуламит Левенберг (Израильский технологический институт Технион).

Введение

Потеря ткани в результате травмы, инфекции или патологических новообразований приводит к масштабным костно-мышечным дефектам. Несмотря на регенеративный потенциал мягких и твердых тканей, заживление значительных дефектов с нарушениями васкуляризации требует применения крупных, васкуляризированных тканевых лоскутов. Хотя аутотрансплантаты по-прежнему считаются клиническим золотым стандартом для масштабной реконструкции, для них характерны такие существенные недостатки, как ограниченный объем аутотрансплантата, морбидность тканей и серьезные послеоперационные осложнения. Как следствие, немалое внимание уделяется естественному регенеративному потенциалу в коррекции тканевых дефектов через применение материалов на основе внеклеточного матрикса (ВКМ) и тканевых конструктов. Известно, что скаффолды на основе ВКМ эффективно поддерживают регенерацию тканей, вызывая наиболее предпочтительную клеточную реакцию и биологическое распознавание при минимальном воспалительном процессе. Децеллюляризированная кость (ДЦК) – клинически одобренный материал на основе ВКМ – способствует регенерации костной ткани через индукцию остеогенеза, прорастание ткани и образование сложных, анатомически корректных костных трансплантатов.

Выживаемость тканеинженерных трансплантатов в операционном поле в первую очередь зависит от инвазии в капилляры хозяина и развития сосудистой сети внутри тканевых конструктов. Отсутствие первичной васкуляризации после имплантации и быстрая васкулярная коннективность между хозяином и трансплантатом служат основными причинами недостаточности биоинженерных конструктов. Костным трансплантатам требуется быстрый анастомоз с сосудистой сетью хозяина для получения питания, так как метаболическая активность клеток кости высока, а диффузионная проницаемость для кислорода составляет всего лишь 200 мкм.

Создание тканеинженерных костных трансплантатов (ТИКТ) со зрелым капиллярным сплетением остается одной из основных проблем отрасли. Эксперты предложили несколько стратегий по ускорению развития сосудистой сети внутри имплантированных костных конструктов, включая инкорпорацию факторов роста и микроархитектурное конструирование капилляров. Еще один подход включает применение сосудистых и микрохирургических техник с целью облегчения прорастания капилляров из окружающих тканей. Несмотря на то, что эти процедуры, подразумевающие манипуляцию макрососудами, могут способствовать первичной пенетрации сосудов в трансплантат, перечисленные методики являются технически сложными и редко используются в коррекции костных дефектов.

Подход, основанный на использовании эндотелиальных клеток и их поддержке с целью индукции преваскуляризации тканевых конструктов, представляется перспективным. СКПЗ – универсальная клеточная популяция внутри пульпы зуба – поддерживает эндотелиальную организацию, а мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани доказанно способствуют созреванию и интеграции децеллюляризированной кости. Мы предполагаем, что тканеинженерные композитные лоскуты на основе преваскуляризированных полимерных матриц, содержащие васкуляризированную децеллюляризированную кость с мезенхимальными стволовыми клетками, облегчают коррекцию костных дефектов и ангиогенез.

Цель работы заключалась в создании первичного композитного тканевого лоскута, состоящего из васкуляризированных мягких и твердых тканевых компонентов, разработанных для коррекции сложных тканевых дефектов. Предлагаемый подход включает преваскуляризацию тканевых конструктов с использованием ко-культуры эндотелиальных и поддерживающих клеток. После этого мы имплантировали деваскуляризированный костный матрикс (ДВК) in vivo в васкуляризированные биоинженерные скаффолды и обернули вокруг крупного артериовенозного (АВ) пучка, получив васкуляризированную ткань, состоящую одновременно из мягких и твердых биоинженерных конструктов. Для того, чтобы продемонстрировать регенеративный потенциал этих модифицированных композитных тканей, мы протестировали их способность заживлять дефекты большеберцовой кости у крыс.

Ход исследования

Процесс создания композитной ткани состоял из нескольких этапов, ведущих к получению васкуляризированной кости с активной сосудистой сетью, внедренной в васкуляризированную ножку из неоткани. В целях преваскуляризации мягких тканей мы погрузили ко-культуры СКПЗ и ЧМЭКЖТ на синтетические скаффолды и использовали монокультуры эндотелиальных клеток для контроля. Для того, чтобы обеспечить возможность проверки развития сосудов и взаимодействия капилляров в процессе приживления, мы использовали ЧМЭКЖТ с белком ZsGreen, введенным методом лентивирусной трансдукции. Затем мы оценили способность преваскуляризированных тканеинженерных скаффолдов к ремоделированию композитной ткани путем применения модели бедренной артериовенозной имплантации, в которой децеллюляризированная кость внедряется во время имплантации тканеинженерных конструктов. Мы проанализировали интеграцию и in vivo васкуляризацию ацеллюлярных костей после индукции остеогенеза. В конце концов, в целях проверки реализуемости предложенной методики мы образовали из композитных тканей ротационные лоскуты, призванные поддержать коррекцию костных дефектов.

Преваскуляризация биоинженерных мягких тканей in vitro

Для создания высоковаскуляризированных биоинженерных мягких тканей, способных поддержать васкуляризацию ДВК in vivo, мы ко-культивировали эндотелиальные клетки (ЧМЭКЖТ) с поддерживающими клетками (СКПЗ) на конструктах PLLA/PLGA в течение 3 и 7 дней. По истечении обоих сроков инкубации в клеточных конструктах наблюдалось развитие сосудов, в то время как в конструктах монокультуры ЧМЭКЖТ признаков явного развития сосудов не обнаружилось. Результаты окрашивания ВКМ-компонентов подтвердили экстенсивное развитие сосудов в преваскуляризированных конструктах, с явными отложениями коллагена IV и эластина вокруг сосудистых сетей в ко-культурах, в то время как в образцах монокультуры наблюдалось неорганизованное и скудное мечение волокон.

Что касается секреции ангиогенных факторов в засеянных клетками конструктах спустя 3 и 7 дней культивирования, в преваскуляризированных скаффолдах отмечались гораздо более высокие уровни фактора роста эндотелия сосудов (VEGF). Уровни ангиопоэтина-1 (Ang1) также значительно повысились в преваскуляризированных конструктах уже на третий день. И напротив: в контрольных монокультурах отмечались более высокие уровни ангиопоэтина-2 (Ang2) по сравнению с ко-культурами.

Формирование васкуляризированных композитных тканевых лоскутов

Для того, чтобы создать васкуляризированный композитный тканевый лоскут и оценить влияние васкулярной организации in vitro на развитие ткани, мы использовали биоинженерные конструкты в модели бедренного артериовенозного пучка. В рамках разработки композитной ткани мы имплантировали контрольные конструкты (монокультуры ЧМЭКЖТ без преваскуляризации) или преваскуляризированные биоинженерные мягкотканные конструкты с децеллюляризированным костным матриксом, присоединенным во время имплантации, с помощью биологического раствора фибрина.

Через 3 недели после имплантации мы обнажили композитные ткани и оценили перфузию и пенетрацию сосудов хозяина. По итогам анализа перфузии in vivo обнаружилось, что количество единиц перфузии на участок ткани преваскуляризированного имплантата выросло почти на 50% в сравнении с имплантатами монокультуры эндотелиальных клеток. Результаты микро-компьютерной томографии (микро-КТ) с высоким разрешением указали на то, что в ДЦК внутри эксплантированных тканей в преваскуляризированной группе проникли кровеносные сосуды хозяина. По сравнению с контрольными монокультурами объем сосудов в исследуемой группе увеличился более, чем в три раза.

Результаты параллельного мечения ВКМ-компонентов трансплантата и сосудов хозяина подтвердили, что ламинин, эластин и коллаген IV типа, секретируемые биоинженерными трансплантатами, выстилают микрокапилляры хозяина, проникшие в модифицированную мягкую ткань. Более того: в образцах из преваскуляризированной группы во время ремоделирования тканей обнаружились не только микрососуды хозяина, но и человеческий CD31 – известный эндотелиальный маркер.

Остеогенно-индуцированные ДЦК с экстенсивной васкулярной пенетрацией in vivo

Для того, чтобы оценить эффект васкуляризации в ацеллюлярных и засеянных остеобластами костях, мы поместили мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани на ДКБ и индуцировали дифференциацию остеобластов. В этих конструктах DCB:osteo наблюдалась клеточная дифференциация и остеогенная секреция ВКМ, подтвержденная результатами окрашивания транскрипционного фактора Runx2, коллагена I и костного сиалопротеина-2 (BSP2) в порах ДЦК, а также отложением минералов до имплантации.

В конструкты DCB:osteo и контрольные ацеллюлярные ДЦК производилась коимплантация мягких тканей вокруг артериовенозного пучка. DCB:osteo индуцировали пенетрацию сосудов хозяина в костные скаффолды; это подтверждается мечением ламинина и альфа-гладкомышечного актина (a-SMA), указывающим на организацию волокон базальной мембраны и перицитов. Как видно по результатам окрашивания CD31+ клетками хозяина, ламинин плотно распределяется вокруг инфильтрирующих сосудов, а Runx2-положительные клетки прилегают к проникающим капиллярам в скаффолдах DCB:osteo.

В ацеллюлярных конструктах наблюдалась меньшая колокализация ламинина с эндотелиальными клетками при частых отложениях ламинина, не связанных с сосудами хозяина. По результатам окрашивания a-SMA обнаружилась организация перицитов вокруг сосудистой сети, которая в имплантатах DCB:osteo оказалась значительно выше (6,1% ± 0,85% против 2,6% ± 0,58%), чем в ацеллюлярных ДЦК. По итогам микро-КТ-ангиографии перфузируемых композитных тканей в DCB:osteo по сравнению с ацеллюлярными имплантатами ДЦК обнаружилась более высокая пенетрация сосудов с почти пятикратным увеличением их объема, более высокая внутренняя коннективность между проникающими сосудами (что видно из значений коннективности Эйлера) и более существенная доля сосудов большого диаметра. Гистологические срезы подтвердили, что конструкты DCB:osteo активно перфузируются, и наполненные эритроцитами капилляры проникают глубоко в поры костной ткани.

Биологический костный матрикс в композитных неотканях улучшил противовоспалительный ответ хозяина в сравнении с синтетическими скаффолдами

После демонстрации благоприятного ответа хозяина на биологический костный матрикс внутри преваскуляризированных конструктов мы произвели оценку потенциала синтетического биоматериала к ремоделированию и реакции ткани. Мы засеяли минерализированные скаффолды поликапролактона-гидроксиапатита (PCL-HA) мезенхимальными стволовыми клетками, перенесшими остеогенную дифференциацию (далее PCL-HA:osteo), подтвержденную результатами окрашивания Runx2, BSP2 и коллагена I.

Спустя 21 день после имплантации результаты лазерной спекл-контрастной визуализации (ЛСКВ) указали на низкую перфузию в тканях, прилегающих к скаффолдам PCL-HA:osteo, в сравнении с тканями, содержащими конструкты DCB:osteo (5,09% ± 1,2% против 44,7% ± 7,3%). По итогам макроскопического исследования на поверхности композитных тканей, прилегающих к костным скаффолдам PCL-HA, обнаружилось частичное растрескивание или детериорация конструкта – явления, указывающие на более низкую интеграцию. По результатам гистологического исследования образцов PCL-HA:osteo удалось выявить реактивный клеточный слой, скапливающийся на поверхности костного скаффолда. В порах скаффолдов отмечалась гораздо более низкая клеточная плотность, а на внутренних стенках конструктов PCL-HA скапливались гигантские клетки инородного тела. В отличие от группы PCL-HA:osteo, по всей модифицированной мягкой ткани и границе DCB:osteo наблюдалось постоянное отложение коллагеновых волокон при более высоких показателях клеточного содержимого внутри пор скаффолда.

Для того, чтобы изучить интеграцию ко-имплантированных биоматериалов in vivo, мы изучили природу ответа хозяина на участке взаимодействия между биоинженерной тканью и костным скаффолдом. В имплантированных тканях PCL-HA:osteo содержались проникающие макрофаги, 20,5% ± 4,4% которых принадлежали к провоспалительному фенотипу M1 (помеченному для CCR7 и CD68), в то время как в конструктах DCB:osteo провоспалительные маркеры экспрессировались менее, чем пятью процентами клеток. Противоположная тенденция отмечалась в отношении ремоделирующих макрофагов M2, на долю которых приходилось почти 20% CD206-положительных иммунных клеток, помещенных в образцы DCB:osteo, и менее 8% таких клеток в скаффолдах PCL-HA:osteo. Результаты иммуногистологического исследования биоинженерных тканей с содержанием DCB:osteo указывали на то, что уже через 3 недели после имплантации в них можно обнаружить клетки остеогенной линии (в отличие от образцов PCL-HA:osteo, в которых обнаружился только слабый Runx2-сигнал).

Биоинженерные композитные ткани, используемые в качестве хирургических лоскутов, способствуют коррекции костных дефектов

Чтобы оценить потенциал лоскутов из композитной ткани в коррекции костных дефектов, мы использовали 21-дневные композитные лоскуты с DCB:osteo в коррекции монокортикального дефекта большеберцовой кости. Прямоугольные дефекты 2х2х5 мм создавались и корректировались либо путем ротации композитной ткани с присоединенным к ней костным скаффолдом, либо путем непосредственной запрессовки не подвергавшихся дополнительному воздействию, неваскуляризированных скаффолдов DCB:osteo в качестве контрольных образцов. Спустя 2 недели после операции на снимках микро-КТ, сделанных in vivo, обнаружились схожие значения объема кости/трабекулярной кости, что означало, что минерализованные ткани в первую очередь состояли из уже существующей кости и имплантированных скаффолдов. На данной стадии показатели заполнения дефекта в обеих группах достигали приблизительно одинаковых значений. Заметные различия в общем объеме минерализованных тканей появились спустя 5 недель после имплантации и достигли более 73% в композитном лоскуте и 63% в группах с DCB:osteo.

Начиная с пятой недели после имплантации отмечалось значительное снижение процентного отношения низкокальцифицированной кости (НКК) в области дефектов, корректируемых при помощи композитных лоскутов. Если вначале на долю НКК приходилось 20% ткани, то к восьмой неделе этот показатель составлял менее 10%. В контрольной группе относительная доля НКК к восьмой неделе снизилась до 15%. Что касается доли высококальцифицированной кости (ВКК), в обеих группах наблюдалось стойкое повышение. Тем не менее, несмотря на то, что доля ВКК в контрольной группе DCB:osteo оставалась в пределах 35-55% на протяжении всего эксперимента, при коррекции дефектов композитными лоскутами доля ВКК к восьмой неделе составляла >60%. Темпы заполнения дефекта указывали на ускоренное отложение костной ткани в период между 5-й и 8-й неделями в группе композитных лоскутов. В группе DCB:osteo коррекция всех дефектов завершилась к концу 8-й недели.

Биоинженерные композитные ткани способствуют васкуляризации костных дефектов и сращению мягких тканей

В конце эксперимента мы произвели перфузию крыс микрофильным контрастным веществом с целью визуализации и количественной оценки кровоснабжения в области дефекта. На рентгеновских снимках перфузируемых задних конечностей обнаружились различия в формировании капилляров в области дефекта. Как и ожидалось, за пределами кортикальной поверхности дефектов, откорректированных скаффолдами DCB:osteo, наблюдались минимальные признаки формирования капилляров. И наоборот: в дефектах, откорректированных композитными лоскутами, отмечалась высокая плотность макрососудов, пронизывающих костный трансплантат и сообщающихся между медуллярной полостью и внешней поверхностью большеберцовой кости. Сосуды, ведущие от крупных бедренных сосудов к биоинженерной ткани, просматривались в 3D-реконструкции образцов.

В целом, в дефектах большеберцовой кости отмечалась более высокая плотность кровеносных сосудов. У животных, имевших одновременно и дефект большеберцовой кости, и дефект тонкой мышцы 8х8 мм, естественная мускулатура прикрепилась к мягкому компоненту биоинженерного композитного лоскута. Высокий уровень a-SMA в композитном лоскуте указывал на хорошую васкуляризацию, отмечавшуюся и в восстановившейся кости, поддерживаемой биоинженерным лоскутом. Более того: масштабы окрашивания мышечных волокон ограничивались мягкой тканью лоскута, соединенной с внешней поверхностью большеберцовой кости и прилегающей нативной мускулатурой, без следов внутри костного дефекта.

Результаты

В масштабной реконструкции широко используются композитные тканевые лоскуты с включением полностью васкуляризированной кости. Для обеспечения выживаемости и интеграции извлеченной кости в лоскутах сохраняется обширная сосудистая сеть, представляющая собой продолжение системы кровообращения хозяина. Вместе с тем для забора аутологичных тканей характерны определенные ограничения.

Несмотря на большое внимание к составу, архитектуре и биологии костных скаффолдов в качестве факторов, обеспечивающих васкуляризацию, всего лишь несколько научных работ посвящено использованию преваскуляризированных тканеинженерных костных трансплантатов с применением аутологичной мягкой ткани в целях создания сосудистой ножки для костных скаффолдов. В рамках представленной работы мы создали композитный неотканевый лоскут на базе биоматериалов, одобренных FDA, с целью разработки васкуляризированных конструктов мягких и твердых тканей. Спустя 21 день инкубации сформировавшиеся композитные ткани интегрировались и васкуляризировались in vivo. Более того: мы мобилизовали композитные ткани в качестве лоскутов для закрытия дефекта большеберцовой кости у крыс и произвели снимки in vivo для оценки коррекции трубчатой кости. Данная методика представляет собой эффективную альтернативу стандартной практике забора тканей и формирования сосудов в кости, применяемой в реконструктивной хирургии в настоящее время.

Композитный лоскут в данной работе основывался на первичной преваскуляризации мягкотканных матриксов с использованием ко-культур СКПЗ и эндотелиальных клеток. СКПЗ – легкодоступная популяция клеток-предшественников, находящихся в пульпарной камере зуба, – представляют собой стволовые клетки, образованные из эктодермы и экспрессирующие маркеры, частично совпадающие с маркерами мезенхимальных стволовых клеток. Благодаря этим свойствам их можно рассматривать в качестве клинически релевантных поддерживающих клеток, подходящих для использования в целях преваскуляризации и обладающих подробно описанным проангиогенным эффектом на организацию и приживление эндотелиальных клеток.

Недавно мы сообщили об успешной регенерации и реваскуляризации травм спинного мозга благодаря применению ко-культуры DPSC:HAMEC (СКПЗ:ЧМЭКЖТ). В рамках представленной работы мы имплантировали биоинженерные конструкты на основе ко-культур DPSC:HAMEC в модель бедренного артериовенозного пучка и соединили их с децеллюляризированной костью. При преваскуляризированных имплантатах наблюдалась динамичная организация сосудов in vivo. Полученные сведения не противоречат предшествующим докладам об имплантации мягких тканей и органов с сосудами, когда преваскуляризация положительно влияла на инвазию капилляров и функцию тканей. В ремоделированных преваскуляризированных конструктах, служивших васкулярными проводниками для децеллюляризированной кости in vivo, наблюдалось тесное взаимодействие между ВКМ-компонентами хозяина и имплантата. Вероятно, структуры, поддерживающие сосуды, сыграли важнейшую роль в формировании ткани.

Через 21 день после первичной имплантации мы произвели параллельное мечение волокон ламинина из биоинженерных конструктов и капилляров хозяина в преваскуляризированных образцах. По всей видимости, ламинин – ключевой компонент развивающихся капилляров – поддерживал стабильность сосудов во время ремоделирования тканей хозяина. Имплантацию также пережили другие имплантат-ассоциированные васкулярные компоненты – эластин и коллаген IV типа. Известно, что они способствуют удлинению и выживаемости неососудов.

Таким образом, имплантированные матричные компоненты сыграли важнейшую роль в сопровождении и поддержке пенетрации и ремоделирования сосудов внутри формирующихся композитных тканей. ВКМ-компоненты опосредовали коннективность и развитие тканей хозяина и имплантата. Параллельное мечение биоинженерных сосудов и проникающих капилляров позволило наблюдать васкулярное ремоделирование биоинженерных конструктов организмом хозяина. Данные наблюдения резонируют с опубликованными результатами исследований, в рамках которых отмечалось быстрое замещение организованных преваскуляризированных матриксов сосудистой сетью хозяина in vivo.

Проблемам создания мягкотканных ножек для сосудистой поддержки костных биоматериалов посвящено ограниченное число опубликованных научных работ. Несколько групп индуцировали васкуляризацию костных скаффолдов через прямое внедрение сосудистого пучка внутрь имплантированного биоматериала. Несмотря на то, что эти процедуры способствуют ветвлению сосудов и последующему формированию кости внутри костного конструкта, дальнейшее применение интегрированного скаффолда в целях закрытия дефекта остается ограниченным.

Кей и соавторы имплантировали скаффолды из кораллового гидроксиапатита (КГА), засеянные мезенхимальными стволовыми клетками костного мозга, в межмышечное пространство лабораторных биглей. Через 4 недели созревания in vivo они провели вторую операцию по лигированию подкожных сосудов с последующей аксиальной ротацией извлеченной мышечной ножки с открытым КГА-скаффолдом к ортотопической области.
Фан и соавторы внедрили скаффолды из бета-трикальцийфосфата (b-TCP) вместе с подкожными сосудами и фасциальным лоскутом в ходе коррекции дефектов большеберцовой кости у макак-резусов.

В обоих исследованиях оптимальные минеральные отложения и пенетрация сосудов в области дефекта наблюдались в костных скаффолдах, засеянных клетками и поддерживаемых сосудистой сетью. Несмотря на то, что эти и другие исследования продемонстрировали внушительный прогресс в регенерации кости в крупных животных моделях, они основываются на извлечении мягких тканей с целью васкуляризации и мобилизации кости. Чаще всего производится забор широчайшей мышцы спины, который вызывает такие осложнения, как послеоперационный болевой синдром. Более того: в данных исследованиях не производилась коррекция мягких тканей, хотя во многих клинических ситуациях костные дефекты сопровождаются масштабными мягкотканными дефектами, усложняющими закрытие и коррекцию. В данной работе васкуляризированный мягкотканный компонент нового лоскута представляет собой результат ремоделирования преваскуляризированного биоматериала. Неоткани окружили кости, получающие полную поддержку от впервые сформировавшейся функциональной сосудистой сети, выявленной по итогам визуализации методом микро-КТ с высоким разрешением.

Децеллюляризированная бычья трубчатая кость получила официальное одобрение и применяется на практике в качестве материала для реконструкции кости. В частности, можно приобрести материалы Cancello-Pure и CopiOs. В многочисленных исследованиях, посвященных имплантации в животных моделях, отмечается недостаточная иммуногенность, так как децеллюляризация подразумевает удаление всего клеточного материала из кости. Несмотря на то, что человеческий костный матрикс выглядит идеальным для создания новой кости, доступность и надежность бычьей кости вкупе с эффективной децеллюляризацией и жестким контролем качества делают ее наиболее предпочтительным материалом для клинической практики. Еще одно преимущество бычьего костного матрикса заключается в его близком сходстве с человеческой костью. Наша группа провела несколько исследований регенерации кости и костно-хрящевых тканей в свиных моделях ортотопической имплантации размером с человека, применив в качестве скаффолда децеллюляризированную бычью кость. В настоящее время данная технология изучается в клинических испытаниях под контролем epiBone.

Остеогенная индукция децеллюляризированной кости, достигнутая за счет засеивания и дифференциации мезенхимальных стромальных клеток в порах скаффолда, положительно влияет на созревание и регенерацию биоинженерной кости даже в моделях для клинического применения. Для засеивания ДЦК in vitro применялись мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани ввиду их чрезвычайного удобства для клинической практики: такие клетки легко извлекаются из липоаспиратов и обладают потенциалом к масштабной экспансии и дифференциации по разным линиям. К окончанию 21-дневного периода инкубации клетки заполняли внутреннее пространство пор впервые выделенными минералами и остеогенным ВКМ.

После формирования неотканей с ацеллюлярной либо индуцированной остеогенезом ДЦК мы изучили композитные ткани и выявили существенные различия в организации сосудов. По результатам гистологического исследования и микро-КТ в конструктах DCB:osteo обнаружилось обилие зрелых проникающих сосудов и близость Runx2-положительных клеток к неокапиллярам в скаффолдах DCB:osteo. В послеродовом развитии и коррекции костной ткани наблюдаются два тесно связанных процесса: ангиогенез и остеогенез. В отличие от клеток иных типов, остеобласты являются основным источником проангиогенных факторов, инициирующих активацию эндотелиальных клеток. Доказано, что эндотелиальные клетки, в свою очередь, воздействуют на костный гомеостаз и остеогенез несколькими способами, включая формирование сосудистых ниш типа H, облегчающих скопление и функцию остеобластов, и такие паракринные эффекты, как передача сигналов Notch и Noggin.

В представленной работе внутри композитных тканей произошла коллективная организация индуцированных остеогенезом мезенхимальных стволовых клеток, биоинженерных эндотелиальных структур и сплетения проникающих капилляров хозяина. Синергический эффект этих клеточных систем может способствовать положительной обратной связи между ап-регуляцией, рекрутментом и дифференциацией клеток хозяина при непрерывном стимулировании процесса образования капилляров. Тем не менее, данные механизмы необходимо более подробно изучить в дальнейших научных работах.

Децеллюляризированная кость, использовавшаяся в представленном исследовании, превзошла синтетические костные скаффолды на основе поликапролактона (ПКЛ). В то время как в биоинженерных конструктах, созданных при помощи костного матрикса, наблюдались благоприятные явления: васкуляризация, пенетрация тканей и нормальный иммунный ответ хозяина, в конструктах, созданных с применением ПКЛ-скаффолдов, развилась нежелательная иммунная реакция. Одной из возможных причин такого результата выступает имплантация и интеграция костных скаффолдов (ДЦК либо ПКЛ) в биоинженерную мягкую ткань, не являющуюся аутологичной тканью. Вероятно, данный фактор усилил иммунную реакцию хозяина, которая могла отличаться динамикой от реакции на инородное тело, задокументированной в моделях подкожной имплантации. Благодаря своей биосовместимости, контролируемой скорости распада и возможности точной модификации под нужды пациента ПКЛ считается ключевым биоматериалом в области инженерии костной ткани. Дальнейшие исследования необходимо сосредоточить на иммуномодулирующих подходах к применению синтетических материалов (в частности, ПКЛ) в предложенных композитных тканях.

Для того, чтобы подчеркнуть регенеративную способность композитных неотканей, мы использовали биоинженерные лоскуты при закрытии монокортикальных дефектов длиной 5 мм. Здесь мы произвели волюметрическую количественную оценку активных сосудов из неотканевых лоскутов и обнаружили, что они численно превосходят сосуды в контрольных образцах, не поддерживаемых лоскутами. Ван и соавторы провели исследование, в котором схожие явления наблюдались при закрытии дефектов бедренной кости у кроликов лоскутами на сосудистой ножке. В костных скаффолдах обнаружилось большее количество проникающих сосудов и более высокие уровни VEGF в закрытых дефектах по сравнению с образцами из контрольной группы. Вероятно, во время приживления кости сосудистая ниша композитного лоскута привела к локализованному повышению уровней VEGF в области костного дефекта. VEGF – это ключевой фактор, инициирующий ранний ангиогенез; он также обнаруживается в пролиферирующих остеобластах в области остеотомии.

Более того: VEGF может привести к опосредованному формированию костной ткани за счет усиления местного кровообращения и повышения проницаемости сосудов. В конечном счете он повышает доступность циркулирующих клеток, способствующих непрерывной коррекции кости, в области имплантации. В рамках данного исследования имплантированная кость непрерывно заполняла дефекты при более быстром ремоделировании кости с низкой плотностью, благодаря чему содержимое композитных лоскутов оказалось более минерализированным по сравнению с содержимым контрольных образцов DCB:osteo.

Эти данные поддерживают наше предположение о том, что сосуды, развившиеся из биоинженерных лоскутов, обеспечивают физическую поддержку рекрутмента клеток хозяина и питание имплантированной кости. Что касается имплантированных мезенхимальных стволовых клеток, через 11 недель после операции внутри неокости содержались остатки человеческих нуклеиновых кислот. Как описано выше и ранее продемонстрировано другими исследователями, трансплантированные мезенхимальные стволовые клетки, по всей видимости, играют переходную роль во время ремоделирования кости внутри лоскутов и последующего закрытия дефектов.

Мы также стремились разрешить такую проблему, как закрытие мягко- и твердотканных дефектов. Мы создали костно-мышечный дефект путем частичной диссекции тонкой мышцы одновременно с костным дефектом. Оставшуюся мускулатуру мы прикрепили к мягкотканному компоненту обнаженного композитного лоскута. Во многих исследованиях рассматривались стратегии коррекции либо костных, либо мышечных биоматериалов, в то время как применение мультифазных имплантатов, состоящих одновременно из мягких и твердых тканей, еще не получило достаточного освещения в тканевой инженерии (в особенности это касается костно-хрящевых и костно-связочных конструктов).

Мы также попытались закрыть костно-мышечный дефект. Через 11 недель после травмы мы закрыли костный дефект кортикальной костью, после чего присоединили биоинженерные лоскуты к наружной поверхности диафиза большеберцовой кости и прилегающей мускулатуры. Хорошая васкуляризация композитной неоткани видна как по итогам мечения a-SMA, так и по итогам изучения сосудистой сети внутри неокости. Результаты окрашивания десмином только в границах присоединенного лоскута подтвердили, что мышечные волокна организовались в неоткани без пролапса мягких тканей в костный дефект. За счет использования этой модели можно предпринять дальнейшие попытки изучения природы мышечной коррекции; так, можно добавить нишу внутрь формирующихся неотканей, располагающих к регенерации мышечных волокон и пенетрации сосудов из соседних тканей. Кроме того, необходимо сосредоточить дальнейшие исследования на закрытии дефектов крупных костей, несущих нагрузку. Более широкое применение композитной ткани и переход к крупным животным моделям помогут с разрешением клинически релевантных проблем.

В представленной работе мы продемонстрировали формирование композитных тканей, включая биоинженерную сосудистую ножку, которая охватывает и васкуляризирует децеллюляризированную кость. За счет использования этих неотканей в качестве аксиальных лоскутов в живой модели имплантации кости мы добились существенного повышения васкуляризации и остеогенеза в дефекте большеберцовой кости. Предложенный подход способен расширить возможности разработки новых заменителей ткани и устранить необходимость в обширном заборе аутологичного материала.

Другие актуальные исследования:

Дата публикации: 30.04.2021