Ихилов Израиль Ichilov
Топ Ихилов
Официальный сайт
Израиль, Тель-Авив, ул. Вайцман 14
Тель-Авив: +972-3-7621629 Москва: +7-495-7773802 Прошу перезвонить

Позвонить в Топ Ихилов

Открытие учёных Института Вейцмана: для лечения тревожных расстройств можно использовать безопасную натуральную добавку

Новое исследование, проведённое на мышах научными сотрудниками Института Вейцмана, показало, что применение натуральной пищевой добавки бета-ситостерина снижает уровень тревожности – как при индивидуальном применении, так и при комплексной терапии с популярным препаратом Прозак, который назначают для лечения тревоги и депрессии. Бета-ситостерин содержится в ряде продуктов питания, в частности, в авокадо. Результаты исследования были опубликованы в научном журнале Cell reports Medicine.

Авторы исследования: Николас Панайотис, Филипп А. Фройнд, Летиция Марвальди, Теви Мельман, Макйл М. Цури, Майк Файнзилбер (Институт Вейцмана, Реховот, Израиль).

Введение

Тревожность и стресс-ассоциированные расстройства представляют существенную проблему для здравоохранения в современном обществе. К сожалению, большинство анксиолитических препаратов нередко вызывают побочные эффекты, из-за чего их длительное применение ограничивается. В представленной работе мы при помощи биоинформационного анализа выявляем препараты, способные служить анксиолитиками.

Сравнение профилей медикаментозно-индуцированной генной экспрессии с гиппокампальным транскриптомом мышиной модели с мутантным импортином-α5 и сниженной тревожностью указывает на определенный потенциал гипохолестеринемического препарата бета-ситостерола. Действие бета-ситостерола подтверждено результатами как интраперитонеального, так и перорального применения в мышиных моделях. Из этого можно заключить, что данный препарат является единственным явным анксиолитиком из пяти близкородственных фитостеролов. Инъекция бета-ситостерола снижает иммобилизационный стресс, контекстуальную память о страхе и активацию c-Fos в префронтальной коре и зубчатой извилине. Более того: при комбинировании субэффективных доз бета-ситостерола с СИОЗС флуоксетином наблюдается синергический анксиолизис. Эти преклинические данные поддерживают дальнейшую разработку бета-ситостерола в качестве самостоятельного анксиолитика либо в качестве препарата, комбинируемого с низкими дозами СИОЗС.

Текущие методы лечения тревожности и стресс-опосредованных расстройств во многом основываются на фармакологической модуляции гормонов и нейромедиаторных систем. Недостаточная действенность и профили побочных эффектов доступных анксиолитиков побудили нас приступить к поиску новых мишеней и лекарственных препаратов, способных исполнять ту же роль. Пути внутриклеточного транспорта – в особенности те, что влияют на ядерно-цитоплазматический обмен, – это перспективный источник новых мишеней для лекарственных средств против различных заболеваний. Импортины – это основные факторы ядерно-цитоплазматического транспорта. Их функции варьируются от ядерного импорта как такового до дальней транспортировки груза от синапса или аксона к ядру. Недавно мы проанализировали поведенческие фенотипы нескольких линий мышиных моделей мутантного импортина-альфа и выявили особую роль импортина-α5 в тревожности и импортина-α3 в хронической боли.

Нокаут или специфический нокдаун импортина-α5 в гиппокампе вызвал значительное сокращение поведенческих паттернов, связанных с тревожностью, и потому мы стремились идентифицировать препараты, дающие аналогичный эффект. База данных с картами межнейронных связей (CMap) позволяет сравнить необходимые транскриптомные профили с профилями генной экспрессии культивированных человеческих клеточных линий, обработанных тысячами клинически одобренных веществ. Мы применили данный подход с целью выявления сходства между мышиным гиппокампальным транскриптомом с нокаутированным импортином-α5 и изменениями в генной экспрессии, вызванными малыми молекулами. В представленном докладе описывается использование CMap с целью выявления потенциала бета-ситостерола как анксиолитика, валидации и оценки специфики его анксиолитического действия и определения характеристик выраженной анксиолитической синергии между этим фитостеролом и известным препаратом флуоксетином.

Ход исследования

Мы подали в CMap запросы на различные дифференциально экспрессируемые гены в мышином гиппокампе с импортином-α5-/-. Как упоминалось выше, такие анализы позволяют идентифицировать одобренные препараты, имитирующие нужный эффект в связи со сходствами в транскриптомном профиле. Мы действительно обнаружили потенциально подходящие препараты с высокими показателями в CMap (>0,75). Далее мы вычленили средства, обладающие такими характеристиками, как способность проникнуть через гематоэнцефалический барьер, возможность перорального приема и относительно низкая вероятность возникновения побочных эффектов. Этим критериям соответствовали пять препаратов:

  1. Бета-ситостерол
  2. Оксамнихин
  3. Флуспирилен
  4. Примахин
  5. Алвеспимицин.

Мы проанализировали возможные анксиолитические свойства этих веществ методом интраперитонеальной инъекции каждого препарата или его наполнителя за 1 час до теста «открытое поле». Бета-ситостерол оказался единственным веществом, продемонстрировавшим явное анксиолитическое действие в этих экспериментальных условиях. Он значительно увеличил пройденное расстояние, число посещений и число подъемов на задние лапы в центральном (то есть, анксиогенном) сегменте открытого поля. Флуспирилен увеличил как расстояние, так и время, проведенное в центральном сегменте. И напротив: ни один из трех оставшихся препаратов не оказал явного влияния на поведение, связанное с тревожностью.

Мы определили минимальную дозу бета-ситостерола в качестве анксиолитика через эксперименты «доза-эффект» и «терапевтическое окно», применяя режимы принудительного перорального приема и интраперитонеального введения препарата. Судя по результатам, у самцов мыши бета-ситостерол вызывает устойчивый анксиолитический эффект при дозировке в 100 мг/кг через 1 час после инъекции. Используя приподнятый крестообразный лабиринт (ПКЛ), мы подтвердили, что спустя 1 час после инъекции доза бета-ситостерола в 100 мг/кг вызвала анксиолитический ответ, существенно увеличив пройденное расстояние и время, проведенное в открытых рукавах ПКЛ. Спустя 6 часов, впрочем, значительного эффекта не наблюдалось.

Более того: во время анализа бета-ситостерол не повлиял на скорость движений животных. После этого мы оценили способность удерживать равновесие и координацию движений методом теста вращающегося стержня, а также механическую и термальную чувствительность методом теста фон Фрея и нагретого датчика. Судя по результатам, спустя 1 час после инъекции животные, получившие бета-ситостерол, вели себя так же, как и их однопометники, получившие инъекцию наполнителя. Эти наблюдения подчеркивают специфичность анксиолитического эффекта.

Мы также протестировали действие бета-ситостерола на самках мышей с использованием ПКЛ. Результаты оказались более разнообразными и не достигли статистической значимости – вероятно, в связи с известным действием эстрального цикла на поведение, связанное с тревожностью, и на эффективность анксиолитиков. Мы использовали данные о самцах мыши и рекомендации FDA и вычислили эквивалентную дозу для человека в 486 мг, а также рекомендованную начальную дозу в 48,6 мг (исходя из того, что стандартная масса тела составляет 60 кг). Такая дозировка входит в диапазон (~2 г в день) применения растительных стеролов в форме пищевых добавок с целью нормализации уровня холестерина.

Растительные стеролы (фитостеролы), включая бета-фитостерол, представляют собой сложные вещества на основе холестерина и используются в качестве «нутрицевтиков» при определенных показаниях, в первую очередь при гиперхолестеринемии. Существует несколько тесно связанных между собой фитостеролов; соответственно, мы также изучили действие стигмастерола, кампестерола, брассикастерола и фукостерола в открытом поле. Удивительно, но несмотря на значительное структурное сходство всех тестируемых стеролов, только бета-ситостерол определенно повлиял на все признаки анксиолизиса в открытом поле в сравнении с группой наполнителя. Фукостерол и брассикастерол воздействовали только на один или два тестовых параметра, соответственно. Стигмастерол и кампестерол никак не повлияли на проявления тревожности даже при тестировании высоких доз. Таким образом, из всех протестированных фитостеролов бета-ситостерол является единственным веществом с выраженным анксиолитическим эффектом.

Для того, чтобы охарактеризовать молекулярные детерминанты бета-ситостерол-индуцированного анксиолизиса, мы произвели секвенирование РНК (RNA-seq) гиппокампов, извлеченной спустя 1 и 6 часов после интраперитонеальной инъекции бета-ситостерола или неанксиолитического стигмастерола. Ряды дифференциально экспрессируемых генов после инъекций бета-ситостерола и стигмастерола практически не совпадали, что подчеркивает специфику действия бета-ситостерола. Бета-ситостерол не влияет на уровни экспрессии семейства импортина-альфа. Это соответствует предположению о том, что потенциально эффективные препараты из CMap скорее имитируют нарушение функции импортина, чем действуют в качестве ингибиторов экспрессии импортина.

Кластеризация k-средних (k=6) позволила выявить ряд из 54 генов со значительной дерегуляцией спустя 1 час после инъекции бета-ситостерола. Эти гены, по всей вероятности, представляют собой молекулярную сигнатуру анксиолитического ответа. К ним относятся такие гены быстрого ответа, как Fos, Arc, Npas4 и Dusp1. Анализы массивов данных при помощи программы «Ingenuity Pathway Analysis» дополнительно подчеркнул сети непосредственно-ранних генов (НРГ), регулируемых инъекцией бета-ситостерола. И действительно: в предыдущих докладах гиппокампальный дефицит Fos у мышей ассоциировался со снижением тревожности и изменением реакции на хронический стресс.

Более того: несмотря на повышение уровней мРНК Npas4 после воздействия стресса, мыши без Npas4 описывались как менее тревожные по сравнению с их однопометниками с гетерозиготными генами и генами дикого типа. Fos – это биомаркер тревожности в миндалевидном теле, гиппокампе и кровотоке. Доказано, что Fos-экспрессирующие нейроны, связанные с памятью, рекрутируют возбуждающие импульсы и способствуют генерализации памяти, в то время как связанные с памятью Npas4-экспрессирующие нейроны рекрутируют ингибирующие импульсы и способствуют дифференциации памяти в зубчатой извилине (ЗИ). Что касается Arc и Dusp1, нокаут каждого из этих генов привел к ослаблению реакций, свидетельствующих о тревожности у мышей. Дезактивация префронтальной коры или гиппокампа в условиях контекстуального страха снижает частоту замирания и экспрессии НРГ, из чего можно сделать вывод о том, что связи между префронтальной корой и гиппокампом частично отвечают за контекстуальное обучение.

В целях дальнейшего изучения даун-регуляции Fos после инъекции бета-ситостерола мы обеспечили выработку у мышей условного рефлекса, связанного с контекстуальным страхом. Протокол состоял из трех фаз:

  1. Привыкания
  2. Выработки рефлекса (две комбинации тона и электрошока, направленного в ноги)
  3. Окончательного контекстного теста.

Мыши получили интраперитонеальные инъекции бета-ситостерола либо контрольного наполнителя за час до помещения в камеру для выработки рефлекса. Мышей умертвили, а их мозги вскрыли спустя 1 час после контекстного теста. В фазе выработки рефлекса в группах бета-ситостерола и наполнителя существенных различий в пройденном расстоянии (см) и длительности замирания (с) не обнаружилось. С другой стороны, после инъекции бета-ситостерола суммарная продолжительность замирания (с) существенно снизилась в сравнении с контрольной группой (наполнитель: 285,1 с ± 3,79; бета-ситостерол: 263,2 с ± 6,16; p < 0,01), что указывает на легкое уменьшение контекстуального страха. Мы извлекли слайсы, содержащие префронтальную кору, гиппокамп и миндалевидное тело, и окрасили их на c-Fos и DAPI.

У мышей, получивших инъекцию бета-ситостерола, обнаружились гораздо более низкие уровни c-Fos в префронтальной коре и зубчатой извилине по сравнению с мышами, получившими инъекцию наполнителя. Вместе с тем значительного снижения c-Fos в CA3-области дорсального гиппокампа или в миндалевидном теле не отмечалось. Полученные результаты указывают на то, что бета-ситостерол снижает экспрессию c-Fos, причем снижение происходит в тех участках головного мозга, которые отвечают за контекстуальную память о страхе, – например, в префронтальной коре и гиппокампе. НРГ представляют собой перспективные объекты дальнейшей научной работы, так как их дерегуляция может отражать нарушения нейронной активности на уровне контура.

Далее мы предприняли попытку изучить потенциальное взаимодействие между бета-ситостеролом и известными анксиолитическими препаратами. Бета-ситостерол – это питательное вещество, которое содержится в растительной пище, зерновых продуктах, злаковых культурах и фруктах. Он продается повсеместно и используется в высоких дозах в качестве нутрицевтика. Учитывая благоприятный профиль безопасности этого вещества, мы задались вопросом о том, позволит ли одновременное введение бета-ситостерола и такого традиционного анксиолитического препарата, как флуоксетин, снизить дозу и свести к минимуму возможные побочные эффекты флуоксетина. Анализ «доза-ответ» с применением флуоксетина продемонстрировал, что дозы в 10 мг/кг и выше оказали на мышей существенный анксиолитический эффект, в то время как дозы в 5 мг/кг и ниже не оказали никакого явного действия. Эти наблюдения соответствуют выводам в опубликованных научных работах.

После этого мы протестировали эффект увеличения дозы бета-ситостерола у мышей, получающих субэффективную дозу флуоксетина в 5 мг/кг. Удивительно, но нам довелось наблюдать синергический эффект субэффективных комбинаций, состоящих из 5 мг/кг флуоксетина и 10, 20 или 50 мг/кг бета-ситостерола. Далее мы проверили потенциал такой комбинации на животных, подвергавшихся хроническому стрессу. В этих целях мы изучили последствия трех недель иммобилизационного стресса у мышей, получавших плацебо, флуоксетин (20 мг/кг), бета-ситостерол (100 мг/кг) или комбинацию 5 мг/кг флуоксетина и 20 мг/кг бета-ситостерола, с результатами мышей, не подвергавшихся стрессу или лечению, в рамках теста на гипонеофагию в отсутствие новизны. Результаты демонстрируют, что в сравнении с мышами, не подвергавшимися никакому воздействию, животные, перенесшие иммобилизационный стресс, приходили к пище с существенной задержкой.

И напротив: мыши, получавшие 20 мг/кг флуоксетина, 100 мг/кг бета-ситостерола или комбинацию из обоих препаратов (5 мг/кг флуоксетина и 20 мг/кг бета-ситостерола) подходили к пище с той же скоростью, что и мыши, не подвергавшиеся стрессу. Полученные данные свидетельствуют о том, что комбинированная терапия бета-ситостеролом и анксиолитиком из семейства селективных ингибиторов обратного захвата серотонина (СИОЗС) может обеспечить лечебный эффект при низкой дозировке и тем самым снизить вероятность возникновения нежелательных побочных эффектов СИОЗС.

Чтобы оценить регионарные различия в концентрациях основных нейротрансмиттеров и аминокислот, мы произвели жидкостную хроматографию в комбинации с тандемной масс-спектрометрией на микробиоптатах, извлеченных из префронтальной коры, дорсальной части полосатого тела, гипоталамуса, гиппокампа, миндалевидного тела и черного вещества мышей дикого типа, получавших инъекции 100 мг/кг бета-ситостерола или контрольного препарата. Изменения в концентрации веществ с log2-кратными изменениями >0,58 считались существенными при p < 0,05. После инъекции бета-ситостерола в префронтальной коре отмечались гораздо более низкие концентрации дофамина, треонина, аланина и цитруллина в сравнении с инъекциями плацебо.

Более того: в гиппокампе снизились концентрации триптофана, метионина и тирозина. Значительных изменений в концентрациях веществ в дорсальной части полосатого тела, гипоталамусе, миндалевидном теле или черном веществе не наблюдалось. В целом, результаты указывают на то, что срочная инъекция бета-ситостерола способна снизить концентрацию нейротрансмиттеров и аминокислот в отдельных участках головного мозга.

Литература связывает некоторые из вышеуказанных метаболитов с модуляцией степени тревожности и/или стресса. К примеру, известно, что применение на грызунах анксиогенных/стрессовых протоколов приводит к аберрантной нейронной активности и специфическому повышению уровней дофамина в префронтальной коре. Уровни нейрональной синтазы оксида азота, отвечающей за превращение аргинина в цитруллин, повышаются в определенных областях головного мозга, связанных со стрессовыми расстройствами, а уровни оксида азота повышаются в плазме крыс при хроническом стрессе. Доказано, что ингибирование синтеза оксида азота в префронтальной коре оказывает антидепрессивный эффект. Примечательно, что ингибитор нейрональной синтазы оксида азота 7-NI и такие СИОЗС, как флуоксетин и венлафаксин, снижают стресс-индуцированную экспрессию c-Fos в областях мозга, частично наложенных друг на друга (включая префронтальную кору).

Для того, чтобы исследовать синергическое действие субэффективных доз бета-ситостерола и флуоксетина на нейрохимическом уровне, мы повторили вышеуказанный эксперимент на животных, получавших и флуоксетин (5 мг/кг, интраперитонеально в течение 3 недель), и бета-ситостерол (20 мг/кг, интраперитонеально за 1 час до забора тканей), и сравнили результаты с результатами животных, получавших соответствующие плацебо. Анализ методом жидкостной хроматографии в комбинации с тандемной масс-спектрометрией позволил установить, что комбинированная терапия приводит к существенному повышению концентраций 5-гидрокситриптамина в префронтальной коре, норадреналина в префронтальной коре и дорсальной части полосатого тела и дофамина в гиппокампе, а также валина, фенилаланина, тирозина и триптофана в черном веществе. При этом концентрации изучаемых метаболитов не изменились ни в гипоталамусе, ни в миндалевидном теле. Соответственно, комбинация бета-ситостерола и флуоксетина в субэффективной дозировке вызывает специфические про-серотонинергические и катехоламинергические реакции в зонах головного мозга, ответственных за регуляцию тревожности. Лечение одним только флуоксетином в дозировке 5 мг/кг не вызвало подобных реакций. Данные наблюдения подтверждают и укрепляют наш вывод о том, что комбинированная терапия оказывает синергическое действие при снижении тревожности.

Результаты

В представленной работе мы выявили выраженное анксиолитическое действие бета-ситостерола и описали синергический эффект комбинации бета-ситостерола с СИОЗС флуоксетином. Несмотря на то, что полученные результаты подчеркивают возможность клинического тестирования такой комбинации, суть механизмов, связывающих фармакологические пути, следует изучить подробнее. В данном контексте следует отметить, что другие исследователи отмечали чувствительность человеческого транспортера серотонина SERT к концентрации холестерина в мембранах. Недавно в научной работе предложили модель, согласно которой флуоксетин может взаимодействовать с мотивом взаимосвязи с холестерином в НФГМ-рецепторе TrkB с целью достижения антидепрессивного эффекта. Эксперты также предположили наличие связи между применением СИОЗС и изменениями в уровнях холестерина.

Таким образом, в будущем было бы интересно проверить, способны ли изменения в конфигурации мембранных липидов, связанные с применением бета-ситостерола, стимулировать взаимодействие между флуоксетином и SERT или активацию сигнального пути флуоксетин-TrkB. Более подробному изучению также подлежат различия в чувствительности самцов и самок мыши к бета-ситостеролу. Особое значение имеет вероятное влияние эстрального цикла или иных гормональных явлений на анксиолитический ответ. И наконец, необходимо тщательнее изучить последствия долгосрочного лечения бета-ситостеролом. Ввиду гидрофобной природы препарата в этих целях, скорее всего, предстоит провести тестирование путем включения бета-ситостерола в рацион животных на длительный срок.

Отмечается острая потребность в новых препаратах для лечения тревожности и стресс-ассоциированных расстройств; вместе с тем открытие и разработка таких веществ по-прежнему представляет сложную задачу. Фитостеролы – это близкие аналоги холестерина, которые содержатся в различных съедобных растениях. Они имеют благоприятный профиль безопасности и историю применения в лечении людей. Фитостеролы могут влиять на несколько биологических процессов через нейропротекторную и антиоксидантную активность, однако их воздействие на функцию головного мозга пока недостаточно изучено. С одной стороны, у мышиной модели с сильно повышенными уровнями фитостеролов с рождения не обнаружилось никаких явных фенотипов памяти или тревожности; с другой стороны, в нескольких исследованиях сообщается о про-эксплоративных или антидепрессивных свойствах неочищенных или частично очищенных растительных стеролов при условии их интраперитонеального введения.

Согласно нашим результатам, бета-ситостерол является единственным специфическим и явным анксиолитиком из ряда родственных фитостеролов, что может объяснить противоречивость сведений о действии смешанных экстрактов фитостеролов. Более того: мы демонстрируем, что бета-ситостерол может действовать синергически с субтерапевтическими дозами СИОЗС флуоксетина. Эти данные свидетельствуют о том, что бета-ситостерол может получить статус анксиолитика и применяться либо в качестве самостоятельного лекарственного средства, либо в синергической комбинации с такими препаратами класса СИОЗС, как флуоксетин.

В данном исследовании применялся виртуальный скрининг с целью идентификации бета-ситостерола в качестве анксиолитического соединения. Несмотря на то, что по нашим данным обнаружился выраженный эффект у самцов мыши, мы наблюдали значительную вариативность в реакциях на бета-ситостерол у взрослых самок мыши. Вариативность, по всей видимости, обусловлена воздействием эстрального цикла на поведенческие паттерны, связанные с тревожностью и депрессией, а также на эффективность антидепрессантов. Соответственно, дальнейшая окончательная оценка анксиолитических свойств бета-ситостерола у самок мыши потребует координирования стадий эстрального цикла и большего количества мышей.

Более того: мы не полностью изучили молекулярные механизмы, обеспечивающие анксиолитический эффект бета-ситостерола – как отдельно, так и в комбинации с СИОЗС. Немедленное анксиолитическое действие бета-ситостерола привлекло наше внимание к быстро индуцируемым генам; тем не менее, мы не можем исключить вовлеченность и других дифференциально экспрессируемых генов в этот анксиолитический механизм. В дополнение понадобится провести дальнейшую функциональную оценку и убедиться в том, что бета-ситостерол действует на уровне синапсиса и/или контура. И наконец, наша стратегия введения бета-ситостерола (принудительный пероральный прием или интраперитонеальная инъекция) ограничила динамику исследования. Проверка долгосрочного действия бета-ситостерола требует парадигм постоянного введения, не искаженных стрессом от повторных инъекций или принудительного кормления. Так как соединение не является однозначно водорастворимым, такой эксперимент потребует долгосрочного снабжения и контроля за потреблением корма, обогащенного бета-ситостеролом.

Другие актуальные исследования:

Дата публикации: 21.05.2021
Работаем без выходных: 24/7
Обслуживание на трех языках: иврит, русский и английский
Введите ваши данные и врач клиники перезвонит вам в течение часа
Whatsapp
с врачом клиники 24/7
×
×
×
×