Ихилов Израиль Ichilov
Топ Ихилов
Официальный сайт
Израиль, Тель-Авив, ул. Вайцман 14
Тель-Авив: +972-3-7621629 Москва: +7-495-7773802 Прошу перезвонить

Позвонить в Топ Ихилов

Роль мелатонина в модуляции микроРНК в клетках трижды негативного рака молочной железы

В результате недавно проведённого исследования было обнаружено, что мелатонин оказывает противоопухолевое действие на клетки рака молочной железы MDA-MD-231.

Авторы исследования: Ливия К. Феррейра (Университет Паулиста «Жулио де Мескита Филью», Бразилия), Франческа Орсо, Даниэла Деттори (Туринский университет, Италия), Джессика С. Лачерда (Университет Паулиста «Жулио де Мескита Филью», Бразилия), Таиз Фю Борин (Университет Огаста, США), Даниэла Таверна (Туринский университет, Италия), Дебора А. П. К. Зуккари (Университет Паулиста «Жулио де Мескита Филью», Бразилия).

Введение

Рак молочной железы – это наиболее часто встречающееся онкологическое заболевание и вторая по распространенности причина смерти среди женщин во всем мире. Высокие показатели смертности в результате неоплазии преимущественно связаны с образованием метастазов, которые обнаруживаются более, чем у 90% пациентов. Несмотря на распространенность патологии, ранняя диагностика и внедрение в практику более эффективных способов лечения позволили снизить показатели смертности и улучшить качество жизни больных. Прогрессирование рака молочной железы зависит от способности клеток поражать отдаленные органы. Диссеминация опухолевых клеток – это комплексный многоэтапный процесс, который включает отделение клеток первичной опухоли, инвазию в местную опухолевую микросреду, выживание в циркулирующей крови и проникновение в другие ткани.

Существует несколько механизмов образования метастазов, и в настоящее время исследователи изучают возможную роль микроРНК как детерминант данного процесса. МикроРНК – это маленькие молекулы РНК примерно с 20-22 нуклеотидами. Они регулируют экспрессию генов на посттранскрипционном уровне и могут индуцировать сайленсинг генов после соединения с таргетными молекулами информационной РНК (мРНК), что приводит к дестабилизации или деградации этих молекул. Одна микроРНК способна связываться с сотнями различных мРНК, регулируя разнообразные клеточные процессы. В литературе содержатся сведения об участии микроРНК как в подавлении опухоли, так и в онкогенезе. Таким образом, дерегуляция микроРНК играет важную роль в пролиферации, инвазии, дифференциации, апоптозе и резистентности клеток различных раковых опухолей. В связи с комплексным характером вовлечения микроРНК в образование первичной раковой опухоли молочной железы и ее метастазов, необходимо исследовать функции микроРНК в целях разработки усовершенствованных стратегий терапии.

Мелатонин – основной гормон, производимый и секретируемый эпифизом, – эффективно подавляет рост и развитие нескольких опухолей. В особенности это касается эстроген-зависимых раковых опухолей молочной железы. Более того: он оказывает модулирующий онкостатический эффект на цитоскелет и способен ингибировать инвазию опухолевых клеток. По итогам недавнего исследования Мао и соавторов выяснилось, что мелатонин, по всей видимости, участвует в подавлении эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП). При этом он способствует мезенхимально-эпителиальному переходу (МЭП) и/или ингибирует ключевые сигнальные пути, связанные с поздними стадиями образования метастазов. На данный момент имеются обширные сведения о внутриклеточных сигнальных путях мелатонина. Вместе с тем его способность модулировать внутриклеточные процессы невероятно сложна и все еще нуждается в более подробном изучении.

Ли и соавторы опубликовали первое исследование о воздействии мелатонина на модуляцию микроРНК в клеточной линии неметастатического рака молочной железы MCF-7. Судя по результатам, физиологические уровни мелатонина способны модулировать экспрессию микроРНК, оказывая антипролиферативный эффект на рак молочной железы. Недавно Сон и соавторы продемонстрировали, как мелатонин повышает экспрессию miR-3195 и miR-374b в раковых клетках простаты. В данном случае высокие уровни экспрессии этих молекул привели к снижению уровней генов, способствующих ангиогенезу и образованию метастазов, – например, индуцируемых гипоксией факторов (HIF-1α) и VEGF. Учитывая, что к настоящему моменту исследователи опубликовали всего лишь несколько работ, посвященных роли мелатонина в регуляции микроРНК, по-прежнему необходимо изучить экспрессию микроРНК и пути, через которые мелатонин может регулировать эти маленькие молекулы.

В данной работе мы исследуем связь между ролью мелатонина в подавлении метастазов и функциями микроРНК в клеточной линии трижды негативного рака молочной железы MDA-MB-231. Основываясь на результатах, мы предполагаем, что мелатонин регулирует способность трижды негативных раковых клеток молочной железы MDA-MB-231 к образованию метастазов и приводит к модуляции микроРНК. Вместе с тем антиметастатический эффект мелатонина не имеет непосредственной связи с определенными модуляциями микроРНК.

Ход исследования

Использовались три разные линии опухолей молочной железы:

  • MDA-MB-231 (метастатический и трижды негативный рак);
  • 4175-TGL (метастатический рак, выделенный из клеточной линии MDA-MB-231);
  • MCF-7 (неметастатический и трижды положительный рак).

Клетки опухолей молочной железы выращивались в среде DMEM с добавлением  10% FBS (Biochrom AG, Берлин, Германия), 1 ммоль пирувата натрия, 25 ммоль HEPES (pH 7,4) и 100 мг/мл гентамицина (все производства Gibco, Invitrogen Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, США).

Посев клеток производился по 5х103 клеток в 96-луночные планшеты, после чего клетки ресуспендировались в среде с добавлением 2% FBS. Спустя 24 часа мы обрабатывали клетки мелатонином (100 нмоль и 1 ммоль) и выращивали их в течение 24, 48, 72, 96 и 120 часов. После обработки мы фиксировали клетки 2,5%-ным глутаральдегидом и окрашивали 0,2%-ным кристаллическим фиолетовым в растворе 10%-ной уксусной кислоты. После этого мы гомогенизировали образцы и оценивали абсорбционную способность при 570 нм при помощи системы Glomax Multi-Detection System (Promega).

Мы произвели оценку миграционной активности клеток с тем, чтобы изучить способность клеток мигрировать после обработки мелатонином (1 ммоль). В эксперименте использовались 24-луночные планшеты с вкладышами (Transwell), имеющие поры диаметром приблизительно 8 мкм (Costar, Corning Incorporated). Мы разместили опухолевые клетки по 1х105 и ресуспендировали их в 500 мкл бессывороточной среды в верхнем отделе вкладыша, добавив 600 мкл среды с 20% FBS в нижний отдел. Мы обрабатывали клетки мелатонином суммарно в течение 48 часов и в ночное время инкубировали их в камере с углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия. После этого мы фиксировали остаток в нижнем отделе 2,5%-ным глутаральдегидом в течение 20 минут и окрашивали 0,2%-ным кристаллическим фиолетовым в течение 20 минут при комнатной температуре. Наконец, мы произвели подсчет всех клеток в нижнем отделе вкладыша при помощи микроскопа Zeiss Axiovert 200M.

Мелатонин снижает пролиферацию клеток MCF-7 и MDA-MB-231

В целях проверки антипролиферативного эффекта мелатонина мы обрабатывали клетки MCF-7 и MDA-MB-231 мелатонином в количестве 100 нмоль или 1 ммоль в течение 24, 48, 72, 96 и 120 часов. В рамках данного исследования клеточная линия MCF-7 использовалась в качестве положительной контрольной пробы при антипролиферативных экспериментах, включая экспрессию c-Myc.

Мелатонин оказывает противораковое действие преимущественно через связывание с рецепторами эстрогена MT1 и MT2. Он также обладает антипролиферативным эффектом. И эстроген-рецептор-положительные, и эстроген-рецептор-отрицательные клеточные линии экспрессируют рецептор MT1. Вместе с тем у эстроген-рецептор-положительных опухолей экспрессия MT1 повышена по сравнению с такими трижды негативными опухолями, как MDA-MB-231. По результатам исследования, статистически значимый ингибирующий эффект в отношении пролиферации наблюдался только после обработки мелатонином (1 ммоль) эстроген-рецептор-положительных клеток линии MCF-7 в течение 48 часов и эстроген-рецептор-отрицательных клеток линии MDA-MB-231 в течение 72 часов.

Мелатонин препятствует миграционной активности и регулирует экспрессию c-Myc в раковых клетках молочной железы

Чтобы исследовать антиметастатическое действие мелатонина, мы произвели оценку миграционной активности клеток MDA-MB-231 и 4175-TGL во вкладышах Transwell с добавлением этого гормона и в его отсутствие. Клетки MCF-7 в данном эксперименте не применялись в связи с их низкой миграционной способностью. Все клеточные линии, обработанные мелатонином в количестве 1 ммоль, продемонстрировали значительно меньшую миграционную способность по сравнению с контрольными клетками, что свидетельствует об антимиграционном эффекте мелатонина на клетки трижды негативного рака молочной железы.

Изменение экспрессии c-Myc после обработки мелатонином оценивалось методом вестерн-блоттинга. Мы оценили экспрессию c-Myc и в клеточной линии MCF-7, так как она служила положительной контрольной пробой. Выяснилось, что мелатонин не модулирует c-Myc в течение 24-часовой обработки. Тем не менее, увеличение времени обработки мелатонином привело к небольшому снижению экспрессии c-Myc. Мелатонин снизил экспрессию c-Myc в клетках MDA-MB-231 спустя 24 часа обработки, однако более продолжительная обработка привела к существенному снижению экспрессии c-Myc.

С учетом того, что в клетках MDA-MB-231 мелатонин более активно модулировал c-Myc, мы задались вопросом о том, проявляется ли его эффект на транскрипционном уровне. По этой причине мы произвели оценку уровней мРНК c-Myc. В клетках, обработанных мелатонином, обнаружилась значительная даун-регуляция c-Myc, что подтвердило результаты анализа белков и позволило предположить, что мелатонин потенциально способен регулировать c-Myc на транскрипционном уровне в трижды негативной клеточной линии.

Результаты

Мелатонин считается важным естественным противоопухолевым агентом, и высокие уровни этого гормона соотносятся с низким риском развития многих онкологических заболеваний. Наши функциональные исследования позволили установить роль мелатонина в ингибировании миграции в трижды негативной клеточной линии MDA-MB-231.

Ранее исследователи, изучавшие рак молочной железы, оценили противоопухолевый эффект мелатонина при эстроген-рецептор-положительных опухолях, при которых мелатонин действует против эстрогена через свои мембранные рецепторы MT1 и MT2. Учитывая эти данные и то, что противораковое действие мелатонина преимущественно основывается на связывании с рецепторами эстрогена, мы использовали клетки MCF-7 в качестве положительной контрольной пробы для обработки мелатонином. Мы обнаружили, что, как и указывается в литературе в отношении эстроген-рецептор-положительных клеток, мелатонин оказывает ингибирующий эффект на пролиферацию клеток, и этот эффект становится статистически значимым спустя 48 часов.

Наибольший интерес, впрочем, представляет тот факт, что мелатонин также нарушает пролиферацию трижды негативных клеток MDA-MB-231. Для того, чтобы подтвердить этот факт, потребовалось установить более длительное наблюдение после обработки мелатонином. На основании этих результатов мы можем предположить, что эффективность мелатонина в отношении трижды негативных раковых клеток проявляется только при условии их более длительной обработки. Аналогично, по результатам недавно опубликованного исследования Ким и Чо (2017) выяснилось, что мелатонин (10 мкмоль) уменьшает миграцию и инвазию клеток из клеточной линии трижды негативного рака молочной железы MDA-MB-231. Вместе с тем авторы не выявили никакого эффекта мелатонина на пролиферацию клеток.

В рамках текущего исследования только самая высокая концентрация мелатонина (1 ммоль) оказалась эффективной против метастатических и эстроген-рецептор-отрицательных клеток. Чтобы достичь терапевтического эффекта, эндогенные вещества зачастую применяются в гораздо более высоких концентрациях по сравнению с физиологической нормой. Содержание мелатонина в сыворотке человеческой крови составляет физиологические 10-9 моль и фармакологические 10-6 моль и выше. Выявленная концентрация мелатонина в плазме в ночное время суток достигает приблизительно 0,1-1 нмоль в пик между 2 и 5 часами утра и 10 пмоль в сыворотке крови в дневное время.

Известно, что мелатонин связывается с мембранными рецепторами M1 и M2 и оказывает антипролиферативный эффект. Рецептор MT1 экспрессируют как эстроген-рецептор-положительные, так и эстроген-рецептор-отрицательные клеточные линии. Тем не менее, исследователи установили, что для эстроген-рецептор-положительных опухолей характерна более высокая экспрессия MT1 по сравнению с трижды негативными опухолями типа MDA-MB-231. Так как у клеток MDA-MB-231 наблюдается дефицит в сигнальном пути MT1 на молекулярном уровне, мелатонин также может влиять на эстроген-рецептор-отрицательные клетки через процессы, не требующие вовлечения мембранных рецепторов MT1/MT2. Липофильная природа мелатонина обеспечивает его проникновение сквозь клеточную мембрану и его взаимодействие с различными транскрипционными факторами и сайтами связывания, модулирующими пролиферацию раковых клеток молочной железы.

Учитывая, что miR-148b и miR-210 ап-регулировались мелатонином, мы изучили отношение этих микроРНК к негативной модуляции c-Myc. Чтобы исследовать связь этих микроРНК, мы изучили гены, имеющие отношение к клеточной пролиферации и образованию метастазов. Кроме того, мы оценили модуляцию c-Myc после обработки клеточных линий MCF-7 и MDA-MB-231 мелатонином. Интересен тот факт, что мелатонин снизил экспрессию c-Myc в клетках MDA-MB-231 спустя 24 часа обработки. Вместе с тем длительная обработка мелатонином привела к стойкому снижению экспрессии c-Myc. И напротив: мелатонин не модулирует экспрессию c-Myc в клетках MCF-7 спустя 24 часа обработки. Существенное снижение наблюдалось только через 72 часа. Чтобы подробнее изучить способность мелатонина подавлять метастазы, мы произвели оценку миграционной активности клеток MDA-MB-231 и 4175-TGL (высокометастатическая клеточная линия, полученная из клеточной линии MDA-MB-231). Как и ожидалось, мы обнаружили, что мелатонин снизил миграцию клеток в обеих линиях трижды негативного рака молочной железы.

Ранее мы продемонстрировали, что мелатонин способен снижать экспрессию генов и белков HIF-1a и VEGF. С другой стороны, исследователям пока не удалось доказать существование механизма, обосновывающего онкостатическое действие мелатонина. Можно, впрочем, предположить, что доказательством существования такого механизма могут служить микроРНК. МикроРНК – это маленькие некодирующие молекулы РНК, отвечающие за модуляцию нескольких кодирующих генов. В настоящее время доказательства того, что микроРНК играют важную роль в прогрессировании опухоли, содержатся в нескольких научных работах. Таким образом, важно понять, как микроРНК препятствуют действию мелатонина на пролиферацию и миграцию опухолевых клеток. На текущий момент данный механизм остается неизученным. Соответственно, в представленном исследовании впервые удалось идентифицировать набор дифференциально модулируемых микроРНК в трижды негативных клетках MDA-MB-231 после обработки этих клеток мелатонином.

Из наиболее дифференциально экспрессируемых микроРНК мы выбрали ап-регулируемые мелатонином miR-210 и miR-148b и использовали их в функциональных исследованиях. miR-148b изучалась в опухолях нескольких типов и действовала как опухолевый супрессор. Низкая экспрессия этой микроРНК тесно связана с более активным прогрессированием опухоли и образованием метастазов. Судя по результатам исследования Чжана и соавторов (2015), высокая экспрессия miR-148b в клетках гепатоцеллюлярной карциномы человека приводит к снижению уровней белка c-Myc. Тем не менее, в рамках нашего исследования повышенная miR-148b не повлияла на действие мелатонина на c-Myc или миграцию раковых клеток молочной железы ни в положительном, ни в отрицательном ключе.

miR-210 считается онкогенной микроРНК и обеспечивает опосредованную регуляцию HIF-1α, супрессора опухолевого роста VHL. HIF-1α способствует повышенной экспрессии miR-210, а микроРНК, в свою очередь, участвует в стабилизации miR-210, что свидетельствует о существовании контура положительной обратной связи. Согласно литературе, высокие уровни miR-210 способствуют более активному прогрессированию рака, уменьшают частоту арестов клеточного цикла и увеличивают миграцию клеток MCF-7. Чжан и соавторы (2009) выяснили, что высокие уровни miR-210 в человеческих клетках карциномы толстой кишки HCT116 приводят к повышению экспрессии c-Myc через снижение MNT – известного антагониста MYC, отвечающего за сдерживание пропролиферативных и проапоптотических функций с-Myc. В то же время мы демонстрируем, что miR-210 в опухолевых клетках ап-регулируется мелатонином. Тем не менее, положительная модуляция miR-210 мелатонином не приводит к более активной пролиферации или миграции этих клеток. Многие исследователи предполагают, что miR-210 может действовать и как опухолевый супрессор, то есть ингибировать онкогенез. Подтверждая это предположение, Джаннакакис и соавторы (2008) продемонстрировали, что индукция miR-210 даун-регулирует E2F3 – важный транскрипционный фактор, участвующий в регуляции клеточного цикла в раковых клетках яичника. Более того: мелатонин отрицательно влияет на экспрессию c-Myc и препятствует миграции клеток с пониженными уровнями miR-210.

Суммируя результаты исследования miR-148b и miR-210, можно заключить, что мелатонин оказывает модулирующий эффект на обе микроРНК, однако эта модуляция не имеет прямой связи со снижением с-Myc и миграцией клеток. Кроме того, обработка опухолевых клеток мелатонином может привести к модуляциям микроРНК, однако эти явления необязательно представляют собой причину и следствие. В отношении модуляции с-Myc можно предположить, что данный ген не является прямой мишенью для miR-148b и miR-210 в клетках трижды негативного рака молочной железы. Мелатонин также может снижать c-Myc через негативную модуляцию других генов – например, HIF-1α. Судя по итогам недавнего исследования, опубликованного Вриндом и Райтером (2016), мелатонин играет важную роль в качестве антиоксиданта и потому не только приводит к снижению АФК (активных форм кислорода), но и регулирует несколько генов, включая HIF-1 и VEGF. При этом мелатонин выполняет опосредованную ингибирующую функцию и оказывает независимое воздействие на рецепторы эстрогена.

Райтер и соавторы (2017) пришли к выводу, что основная роль мелатонина на молекулярном уровне остается неясной. Чрезвычайно полезные функции мелатонина идентифицируются и рассматриваются только в качестве побочных явлений его неизвестной фундаментальной функции. Что касается мелатонин-индуцированной модуляции микроРНК, мы предполагаем, что это также всего лишь «побочное явление», обусловленное его общей Dicer/Drosha-дерегуляцией. Аналогичным образом, в исследовании Мари и соавторов (2016) мелатонин (1 мкмоль) даун-регулировал экспрессию miR-24 через ингибирование hnRNP A1 – белка, участвующего как в сплайсинге мРНК, так и в созревании микроРНК. Более того: авторы отметили, что уровни мРНК не регулировались мелатонином, а значит – мелатонин регулировал hnRNP A1 на посттранскрипционном уровне. Вышеуказанные наблюдения Мари и соавторов (2016) подтверждают результаты нашей работы и указывают на возможность опосредованной модуляции микроРНК мелатонином. С другой стороны, мелатонин также может действовать через легкие модуляции групп микроРНК, а не через конкретную молекулу, и в таком случае исследование его вмешательства в микроРНК представляется затруднительным. Уже известно, что одна микроРНК потенциально способна модулировать экспрессию сотен генов, из-за чего комплексное прогнозирование ее воздействия на клетку становится очень сложной задачей.

Таким образом, необходимо и в дальнейшем исследовать связь мелатонина с микроРНК, c-Myc, пролиферацией и миграцией клеток. Представленная работа позволила прояснить роль мелатонина в вероятном пути образования метастазов с вовлечением регуляции микроРНК в трижды негативной клеточной линии MDA-MB-231. Соответственно, эти результаты необходимо подкрепить, и в настоящее время уже проводятся дальнейшие эксперименты с целью конкретизации роли мелатонина в данном процессе.

Другие актуальные исследования:

Работаем без выходных: 24/7
Обслуживание на трех языках: иврит, русский и английский
Введите ваши данные и врач клиники перезвонит вам в течение часа
Whatsapp
с врачом клиники 24/7
×
×