Восстановление осязания с помощью трибоэлектрического наногенератора

Израильские учёные разработали технологию. позволяющую восстановить утраченное в результате травмы осязание.

Так называется исследование учёных из Тель-Авивского университета, разработавших инновационную технологию, которая дарит надежду людям, потерявшим осязание из-за ампутации конечности или травмы. Технология уже была успешно протестирована на животных и предусматривает использование микроскопического датчика, который имплантируется в нерв повреждённого органа, например, в палец, и подключается в здоровому нерву. Датчик активируется при прикосновении к другим объектам. Технология может использоваться для любой части тела.

Авторы исследования: Ифтах Шломи, Шай Дивальд, Кешет Тадмор, Яэль Лихтман-Бардуго (Тель-Авивский университет, Израиль), Амир Арами (МЦ Шиба, Израиль), Бен М. Маоз (Тель-Авивский университет, Израиль).

Введение

Потеря осязания часто отмечается у пациентов с травматическими повреждениями периферических нервов или потерей мягких тканей. В настоящее время, впрочем, спектр способов восстановления осязания остается ограниченным. Имплантируемые нейропротезы представляют собой перспективное направление в области восстановления осязания, однако для доступных технологий характерны существенные недостатки, включая сложность использования и производства и необходимость в источнике внешнего энергоснабжения.

В представленной работе мы предлагаем, производим и демонстрируем в действии трибоэлектрический наногенератор (TENG) как относительно простой, биосовместимый, чувствительный и гибкий прибор с автономным источником питания и способностью восстанавливать осязание. Данный интегрированный тактильный TENG (TENG-IT) имплантируется под кожу и переводит тактильное давление в электрический потенциал, передаваемый через манжетные электроды в здоровые сенсорные нервы. Таким образом, происходит стимуляция сенсорных нервов с мимикрией под тактильное ощущение.

Мы демонстрируем, что прибор вызывает электрическую активность в нейронах in vitro и что масштаб этой активности зависит от уровня оказываемого на прибор тактильного давления. Затем мы демонстрируем функцию TENG-IT in vivo, доказывая, что он обеспечивает способность к осязанию (измеряемую по методу фон Фрея) у крыс, перенесших блокаду осязания в задней лапе через рассечение дистального большеберцового нерва. Эти данные свидетельствуют о значительном потенциале автономных имплантированных устройств на основе TENG как средств восстановления осязания.

Травматическое повреждение периферических нервов – это распространенное нарушение, которое встречается у 2,8% пациентов с травмами и может привести к пожизненной инвалидности, хронической боли и снижению качества жизни. Частым последствием травматического повреждения периферических нервов выступает потеря осязания, которая не только препятствует ведению привычного образа жизни, но и увеличивает предрасположенность к новым травмам. В настоящее время существует лишь несколько способов восстановления осязания. Золотым стандартом является реконструкция нерва при помощи аутотрансплантата нерва, нервного проводника или аллотрансплантата нерва. К сожалению, реконструкцию нерва можно провести только в ограниченные сроки (т.е., в течение первых двух лет после травмы), и для этого требуется здоровая кожа с функционирующими нервными окончаниями. Более того: даже при наличии всех этих условий показатели успешности остаются низкими.

Альтернативным перспективным направлением в области восстановления осязания считается разработка портативных или имплантируемых нейропротезов, симулирующих ощущения, возникающие при прикосновении. Симуляция осуществляется через перевод давления вокруг пораженной области в электрические сигналы, распознаваемые головным мозгом. Эксперты предложили и внедрили несколько таких устройств на основе различных технологий, и в данной сфере непрерывно появляются инновации. Наибольшего внимания удостоились такие технологии, как нейрокомпьютерный интерфейс и «электронная кожа», которая имитирует не только сенсорные свойства кожи, но и ряд ее биологических свойств (напр., эластичность).

Вместе с тем технологии нейропротезирования все еще развиваются, и лишь некоторые из них прошли контрольное тестирование in vivo. Более того: инструменты, разработанные на данный момент, имеют несколько ключевых недостатков.

Во-первых, их разработка стоит дорого, а внедрение сопряжено с дополнительными сложностями; для некоторых из таких инструментов (напр., для электронной кожи) требуются особые поддерживающие платформы. Судя по данным характеристикам, процесс адаптации текущих технологий и разработки приборов, подходящих для широкого использования в клинической практике, по всей вероятности, затянется, и без существенного снижения затрат конечный продукт в любом случае может остаться недоступным для многих пациентов.
Во-вторых, текущие технологии нейропротезирования подразумевают поступление энергии от внешнего источника электроснабжения или батареи. Такие источники питания неудобно менять, и в случае их неисправности в организм пациента могут попасть токсичные материалы.
В-третьих, технологии нейропротезирования, уже внедренные в практику, требуют длительной тренировки и привыкания к нейропротезу.

Очевидно, что имплантируемым устройствам для восстановления осязания предстоит долго развиваться. В идеале подобный прибор должен не только преодолеть недостатки текущих и инновационных технологий, но и отвечать сразу нескольким критериям. В первую очередь, прибор должен состоять из биосовместимых материалов, предотвращающих повреждение тканей вокруг имплантата. Кроме того, он должен быть гибким, долговечным и компактным. Еще одной важной характеристикой является широкий спектр чувствительности, аналогичный нормальному восприятию давления человеком, в диапазоне от нескольких кПа при легком касании до десятков кПа при манипуляции предметами. Дополнительной желательной характеристикой выступает простота разработки и имплантации, предполагающая, что прибор будет доступен для большинства пациентов.

В представленной работе мы предлагаем использовать недавно разработанную технологию с целью создания практичных устройств для восстановления осязания, потенциально отвечающих вышеперечисленным критериям и при этом не обладающих недостатками существующих нейропротезов. Мы предлагаем использовать трибоэлектрический наногенератор (TENG), конвертирующий механическую энергию в электричество через сочетание трибоэлектризации и электростатической индукции.

В нескольких недавно опубликованных исследованиях эксперты продемонстрировали значительный потенциал технологии TENG в различных сферах (напр., оценка качества воды, технология «голубой энергии») и, в частности, в биомедицинской промышленности. В последних работах продемонстрировано, что TENG можно использовать в целях получения биомеханической энергии. Соответственно, устройство может как способствовать заживлению нервов, так и служить автономным источником питания для медицинских приборов.

Необходимо отметить, что благодаря чувствительности TENG к давлению это устройство считается перспективным кандидатом в приборы для восстановления осязания. В представленной работе мы начинаем изучать его потенциал через разработку интегрированного (IT) устройства для восстановления осязания (TENG-IT) и демонстрацию его функциональности in vivo.

TENG-IT – это самопитаемое устройство, которое имплантируется под кожу (напр., на кончике пальца) и трансформирует прикосновение в электрическое напряжение. Напряжение, в свою очередь, передается в здоровые сенсорные нервы через манжетные электроды и стимулирует периферические нейроны пропорционально давлению, оказываемому на прибор. Устройство состоит из небольшого числа компонентов и конструируется из доступных материалов; более того: процесс его разработки достаточно прост.

Далее мы подробно рассматриваем нюансы разработки устройства TENG-IT и демонстрируем его способность стимулировать периферические нейроны in vitro и обеспечивать осязание у грызунов с удаленным сегментом сенсорного нерва. Таким образом, в данной работе представлено недорогое, доступное, самопитаемое и чувствительное устройство для восстановления осязания.

Ход исследования

Производство TENG-IT

В целом, TENG-IT, как и TENG, описанные в предыдущих исследованиях, не касающихся биомедицины, состоит из нескольких разных слоев с разными функциями. Внутренний слой – фрикционный; он создает трибоэлектрический эффект, обеспечивающий автономность устройства. Слои разделены тонкими, гибкими полосами; эти разделители обеспечивают контакт и разграничение фрикционных слоев, создавая трибоэлектрический заряд. Каждый фрикционный слой соединяется с проводящей пленкой, выполняющей функцию электрода и облегчающей передачу заряда.

Устройство покрыто биосовместимым изолирующим материалом (ПДМС и фибриновый клей), предотвращающим контакт с окружающей физиологической средой. Мы произвели и протестировали устройства различных размеров и форм в диапазоне от 24 мм2 до 25 см2. В конечном итоге в экспериментах по разработке и описанию характеристик TENG-IT мы использовали устройство с площадью поверхности 5 мм x 5 мм; в экспериментах in vitro мы использовали устройство с площадью поверхности 5 мм x 5 мм; для того, чтобы усовершенствовать размер устройства для экспериментов in vivo, мы удлинили его в соответствии с формой лапы и получили прямоугольную поверхность площадью 8 мм x 3 мм (24 мм2).

Золотое напыление

Полосы Kapton (Ka; «Dupont», Делавэр, США) толщиной 125 мкм служат основой структуры прибора, обеспечивая его высокую гибкость и прочность. На полосу Kapton мы произвели титановое напыление, использовав адгезионный слой титана (Ti) толщиной 5 нм и метод электронно-лучевого напыления (VST, TFDS-870). Мы также произвели напыление золотого (Au) слоя толщиной 100 нм тем же методом поверх титанового слоя, выполняющего функцию электрода.

В наших экспериментах по описанию особенностей влияния толщины пленки Kapton на работу TENG-IT толщина «плотного» слоя пленки составляла 125 мкм (номер в каталоге: 677-930-79), а толщина «тонкого» слоя пленки Kapton достигала 13 мкм (номер в каталоге: 488-784-98).

Адгезивная обработка

Чтобы улучшить соединение диэлектрических материалов со слоем золота, мы погрузили полосы Ka-Au на 30 мин. в меркаптогексадекановую кислоту (MHDA; Sigma-Aldrich, Реховот, Израиль), разведенную в пропорции 1:100 с этиловым спиртом (Bio lab, Иерусалим, Израиль), и тем самым создали самоорганизующийся монослой тиолов для улучшенной адгезии с нейлоном-6-6 (Sigma-Aldrich, Ревохот, Израиль) и ацетобутиратом целлюлозы (CAB; Sigma-Aldrich, Ревохот, Израиль).

Подготовка диэлектрических материалов

Мы смешали ПДМС (Sigma-Aldrich, Ревохот, Израиль) в пропорции 1:10 с вулканизирующим средством (Sylgard 184, Sigma-Aldrich, Ревохот, Израиль). Бусины нейлона-6-6 мы растворили в гексафтор-2-пропаноле (HFIP; Sigma-Aldrich, Ревохот, Израиль) в пропорции 60 мг/мл и обрабатывали ультразвуком на 45° в течение 30 мин. Ацетобутират целлюлозы мы растворили в метилизобутилкетоне (MIBK; Sigma-Aldrich, Ревохот, Израиль) в пропорции 84 мг/мл. Раствор мы размешивали до полного растворения CAB. В целях улучшения адгезии мы пропитали электроды CAB и Ny раствором MHDA (7,2 мг/мл в этиловом спирте).

Покрытие методом центрифугирования

Удерживая базу Ka-AU в вакууме, мы покрыли ее диэлектрическими материалами (PDMS, Ny, CAB) методом центрифугирования (Ni-Lo Scientific, Оттава, Канада) при скорости вращения 1000, 1800 и 1800 об/мин. для PDMS, CAB и NY, соответственно. Каждый этап покрытия длился 60 с, и окончательная скорость вращения с ускорением достигла 200 раундов/с2. Крупные образцы (когда размер TENG-IT превышал 10 мм x 10 мм) мы залили 500 мкл диэлектрического материала в жидкой форме и использовали для описания первичных характеристик TENG-IT. Маленькие образцы (5 мм x 5 мм) мы залили 200 мкл жидкого диэлектрического покрытия.

Отверждение

На ночь (12 ч) мы оставили полосы Ka-Au, покрытые PDMS, на отверждение при 60° (ThermoFisher Scientific, Кирьят-Шмона, Израиль). Полосы Ny и CAB Ka-Au подверглись естественной сушке и соединению перед сборкой устройства и последующими измерениями.

Создание электрических цепей

Поверхность с золотым напылением мы защитили от покрытия с помощью эластичной односторонней клейкой ленты. После окончательного присоединения и отверждения диэлектрического материала мы удалили клейкую ленту и подсоединили медный провод с оголенным концом, используя быстросохнущую серебряную либо золотую краску (Ted Pella, Реддинг, Калифорния, Соединенные Штаты) на открытом участке с золотым напылением.

Разделение

Мы поместили тонкие полосы клейкой ленты Very High Bond (VHB; 3M, Teva Pharmaceuticals, Шохам, Израиль) различной толщины (0, 125, 250, 500, 750, 1000, 1500 и 2000 мкм) поверх слоя PDMS на верхнюю часть TENG-IT с каждой стороны. Другую сторону TENG-IT со слоем Ny/CAB мы перевернули и поместили непосредственно над слоем PDMS (и разделили по бокам полосами VHB). Окончательная высота оказались 750 мкм.

Герметизация

Мы загерметизировали TENG-IT с обеих сторон тонким слоем 3M VHB в 125 мкм и укрепили края фибриновым клеем (Evicel – Omrix Biopharmaceuticals, J&J, Нес-Циона, Израиль).

Характеристики устройства

Линейный двигатель для TENG-давления

Мы имитировали контролируемое постукивание пальцем с помощью промышленного линейного двигателя, оснащенного системой обратной связи с датчиком Холла (Faulhaber, Hx 3600, Шёнайх, Германия). Электричество для системы мы получили путем подсоединения к стандартному источнику питания с напряжением 12 В. Мы прикрепили двигатель к специально сконструированной алюминиевой платформе для точного позиционирования.

Контроль двигателя (и, соответственно, давления, оказываемого на прибор) осуществлялся при помощи программного обеспечения EasyMotion Studio (Faulhaber, Шёнайх, Германия). Мы запрограммировали трапециевидную замкнутую петлю, воспроизводящую непрерывное, продолжительное постукивание о двигатель. Мы настроили базовое движение с высоты 0 мм (полный контакт с TENG-IT) до 14 мм (полное отсутствие контакта). Давление вычислялось по ф. 2, где Mrod обозначает массу стержня и крышки линейного двигателя согласно экспериментальным измерениям (105 г); Amotor обозначает ускорение стержня по направлению вниз согласно настройке программы; и Sdevice обозначает площадь поверхности прибора, на которую оказывается давление.

Запись

Мы подсоединили два электрода TENG-IT к считывающему устройству (NI6003; National Instruments [NI], Холон, Израиль). Мы также измерили напряжение в разомкнутой цепи и зафиксировали его при помощи программы NI DAQExpress 2.0. Частоту дискретизации мы установили на 25 000 Гц. Запись выходного напряжения TENG анализировалась с помощью специально составленного кода MATLAB.

Анализ данных TENG-IT

Все эксперименты проводились три раза. Мы экспортировали записи в 30 с выходного напряжения TENG-IT в формат .csv и анализировали их с помощью специального составленного кода MATLAB.

Описание характеристик TENG-IT в сухих условиях

Мы поместили герметизированные устройства TENG-IT в чашку Петри на 36 ч. Двигатель производил непрерывное постукивание с частотой 4,5 Гц.

Описание характеристик TENG-IT в биологических условиях

Мы поместили герметизированные устройства TENG-IT в чашку Петри, покрыли их натрий-фосфатным буфером (PBS) и поместили в биологический инкубатор при 37° на 26 дней. В условиях каждого измерения двигатель производил постукивание с частотой 1 Гц в течение 30 мин. Статистический анализ производился по 30-секундным записям по завершении 30-минутного периода постукивания.

Активация спинальных ганглиев in vitro

Покрытие пластин микроэлектродных матриц

Мы озонировали пластины микроэлектродных матриц (Multi Channel Systems 200/30; Multi Channel Systems, Ройтлинген, Германия) в течение 30 мин. в условиях стерилизации ультрафиолетом. За день до культивирования клеток мы покрыли пластины 500 мкл поли-D-лизина (PDL; Sigma-Aldrich, Ревохот, Израиль), смешанного с PBS (Sigma-Aldrich, Ревохот, Израиль) в пропорции 1:50, и поместили их на ночь в инкубатор. В день посева мы удалили PDL и трижды промыли пластины PBS, прежде чем покрыть их 1 мл раствора ламинина (20 мкг/мл в среде для чашек Петри) (Sigma-Aldrich, Ревохот, Израиль). Перед посевом мы инкубировали пластины в течение 2 ч, после чего дважды промыли их PBS.

Экстракция спинальных ганглиев и посев клеток

Мы заморозили мышиные эмбрионы штамма ICR (Envigo Laboratories, Иерусалим, Израиль) при E12.5, после чего поместили их в сбалансированный солевой раствор Хэнкса (HBSS; Sigma-Aldrich, Ревохот, Израиль). Оболочки спинного мозга мы отделили по протоколу, детально описанному Перлсоном и соавторами. Мы изолировали эксплантаты спинальных ганглиев от мозговых оболочек хирургическим методом при помощи микроскопа L1-L9 и поместили их в центр пластины микроэлектродной матрицы (1 эксплантат на каждую пластину, приблизительно 2000-3000 клеток). Мы покрыли эксплантаты 5 мкл Матригеля (Корнинг, Нью-Йорк, Соединенные Штаты), обогащенного водным раствором фактора роста нервов (NGF; Alomone laboratories, Иерусалим, Израиль) в пропорции 5 мкг/мл. Соотношение между раствором NGF и Матригелем составило 1:100 – именно такое соотношение обеспечивало плотность прилегания эксплантатов и их максимальную близость к электродам.

Мы поместили эксплантаты в инкубатор (37°, 5% CO2) на 30 мин., после чего добавили на каждую пластину 2 мл питательной среды. Среда состояла из 96% Neurobasal (Gibco, ThermoFisher Scientific, Rhenium, Модиин-Маккабим-Реут, Израиль), 2% B-27 (Gibco, Rhenium, Модиин-Маккабим-Реут, Израиль), 1% смеси пенициллин-стрептомицин (Sigma-Aldrich, Ревохот, Израиль) и 1% GlutaMAX (Gibco, ThermoFisher Scientific, Rhenium, Модиин-Маккабим-Реут, Израиль).

Мы заново обогатили питательную среду 5 мкг/мл NGF в день добавления/замены среды. Замена питательной среды производилась на следующий день после посева и затем каждые два дня. Измерения электрической активности производились на 4 день эксперимента in vitro.

Измерения электрической активности

Мы вставили пластины микроэлектродных матриц в мини-MEA ридер (Multi Channel Systems) внутри инкубатора. Ридер мы подключили к записывающему компьютеру через специальный адаптер и контроллер (Multi Channel Systems). Запись производилась при частоте дискретизации в 10 000 Гц. Исходная активность каждой пластины или образца записывалась в течение 5 мин. Затем мы произвели стимуляцию каждой MEA-пластины (химическую стимуляцию, электрическую стимуляцию через MEA или стимуляцию TENG-IT; см. ниже) и проанализировали 6-10 наиболее активных электродов в пластине.

Анализ данных MEA

Неструктурированные данные от всех электродов записывались программой Multi Channel Systems Experimenter. Дальнейший анализ производился при помощи программного обеспечения NeuroExplorer. Мы пропустили данные через полосовой фильтр в нейрональном диапазоне активности (200-4000 Гц). В качестве пиков мы определили 4 стандартных отклонения нижнего и верхнего порогов. Мы сгенерировали растровые графики и гистограммы частот для 6 самых активных электродов, в области которых наблюдался видимый рост аксонов/наличие тела клетки.

Химическая стимуляция

Мы добавили к питательной среде на каждой пластине 50 мм хлористого калия (KCl; Sigma-Aldrich, Ревохот, Израиль). Запись останавливалась по истечении 2 мин. либо в случае отсутствия электрической активности в зависимости от того, какое из этих двух условий наступало раньше.

Электрическая стимуляция/Стимуляция через MEA

Стимуляция спинальных ганглиев производилась через функцию внутренней стимуляции коллектора сигналов (SCU), предоставляемую программным обеспечением системы MEA (Experimenter Software, Multi Channel Systems). Все 60 электродов использовались в качестве активных стимуляторов. Мы применили «первичный набор» стимулов к каждой клеточной культуре. Первичный набор представлял собой последовательность из 10 импульсов с интервалом в 10 с между двумя последовательными импульсами. Каждый импульс состоял из 10 повторов сигнала в 1000 мВ с шириной импульса 750 мкс при частоте 100 Гц. Общая продолжительность первичного комплекса составила 100 с.

Эта процедура стимуляции основывается на ранее опубликованных исследованиях, посвященных стимуляции спинальных ганглиев на микроэлектродных матрицах. Запись останавливалась спустя 5 мин. либо в случае отсутствия электрической активности (1 или менее пиков в минуту) в зависимости от того, какое из этих двух условий наступало раньше.

В наших экспериментах по оценке реакции спинальных ганглиев на различные уровни напряжения мы осуществляли стимуляцию с возрастающей амплитудой напряжения (10, 50, 100, 250, 500, 750, 1000 и 1500 мВ, соответственно). Каждый образец единожды подвергался 10 повторам импульсов по 1000 мВ, 100 Гц. Затем мы приступили к стимуляции с исходной записью в 2 мин.

Стимуляция TENG-IT

После вышеописанной процедуры подготовки MEA мы приступили к стимуляции спинальных ганглиев TENG-IT, соединенным с MEA металлическими проводами. Мы настроили TENG-IT на 10 стимуляций в секунду на протяжении 0,5 с.

Имплантация TENG крысам и проверка осязания

Подготовка устройства

Устройства, предназначенные для имплантации, имели площадь поверхности 8 мм x 3 мм; среднее напряжение от пика к пику, зафиксированное до имплантации, достигало 1,0-1,5 В. Перед тем, как приступить к процессу имплантации, мы стерилизовали все устройства этиловым спиртом и PBS.

Животные и последовательность процедур

Мы получили самок крыс линии Wistar (возрастом 12 недель; n=9) от Envigo (Израиль) и содержали их в условиях 12-часового цикла свет-темнота. Стерилизованный в автоклаве корм для грызунов (Koffolk 19–510; Koffolk Ltd., Петах-Тиква, Израиль) и стерильная вода предоставлялись крысам без ограничений. Все экспериментальные процедуры получили одобрение Комитета по содержанию лабораторных животных при Тель-Авивском университете в соответствии с национальными методическими рекомендациями (разрешение №01-19-029).

Перед тем, как приступить к хирургическим процедурам, мы поместили всех крыс (группы контроля, ампутантов и TENG-IT) в помещение для животных на неделю для привыкания. Крысы, перенесшие процедуру имплантации, перед тестом фон Фрея выздоравливали 10 дней. Тест фон Фрея производился на каждой крысе приблизительно каждые 3-4 дня на протяжении 19 дней (5 измерений на крысу). В дальнейшем мы умертвили животных, извлекли образцы тканей и произвели окрашивание в целях иммуногистохимического исследования.

Хирургическое картирование нервов

Мы произвели разрез в форме перевернутой «L» по задней лапе, с боковой стороны. Кожный лоскут мы сдвинули из латеральной в медиальную плоскость. Затем мы отсекли сенсорные ответвления к коже, идентифицировали и иссекли дистальный большеберцовый нерв и его ветви. Мы проверили состояние медиального и латерального подошвенных нервов во всех задних лапах.

По нашим наблюдениям, медиальный подошвенный нерв имел сенсорные ветви на большей части центрального сегмента лапы; с боковой стороны располагался латеральный подошвенный нерв. Ветвь медиального большеберцового нерва охватывала медиальные 4 пальца, ветвь латерального подошвенного нерва – боковые 2 пальца.

Хирургические процедуры: рассечение сенсорного нерва и имплантация TENG-IT

Перед операцией мы ввели крысам групп ампутантов и TENG-IT анестетик. После этого мы произвели надрез в боковой части левой задней лапы (как описывалось выше) и удалили сегмент медиального и латерального большеберцового нерва.

Крысам группы TENG-IT мы подкожно имплантировали TENG-IT в центральную часть лапы. Мы подсоединили устройство к терминальной части рассеченного большеберцового нерва с помощью манжетного электрода (2 Micro Cuff Tunnel 0,0000 1.556,70 200/Pt–Ir/2 mm long/0.5 mm C2C/0.2 x 0.5 mm O/Cable 30 cm entry lateral – weld tube 001; CorTec, Сент-Пол, Миннесота, Соединенные Штаты). Для обеспечения правильного позиционирования и соединения электрода с нервом использовался шовный материал нейлон 9-0.

Мы зашили хирургический разрез, используя шовный материал нейлон 5-0, и обеспечили крысам лечение антибиотиками и обезболивающими средствами (Римадил; Vetmarket, Шохам, Израиль). После операции крысы выздоравливали в течение 10 дней до начала тестов фон Фрея.

Послеоперационный уход

Крысы содержались в отделении ухода за лабораторными животными в Тель-Авивском университете и имели возможность двигаться без ограничений. Каждая крыса на протяжении трех дней после операции носила на шее защитный ошейник, предотвращающий повреждение заживающей раны самой крысой. В течение первой недели реабилитации крысы получали обезболивающие препараты и антибиотики. Мы ежедневно производили оценку заживления раны и измеряли вес. Спустя приблизительно 10 дней мы зафиксировали полное заживление операционной раны.

Оценка движения после операции

Для оценки движения крыс после хирургической процедуры мы сняли всех крыс, включая контрольную группу, на видео, и вычислили время, проведенное каждой крысой на задних лапах на протяжении 1-минутного видео.

Тест фон Фрея

Аппарат фон Фрея (Ugo Basile, Италия) представляет собой приподнятый горизонтальный стенд из проволочной сетки. Крыса стоит на проволочной сетке, внутри конструкции из оргстекла с открытым дном. Мы оказываем давление на лапу крысы снизу. Когда крыса поднимает лапу, что свидетельствует о чувствительности к оказанному давлению, максимальная сила автоматически фиксируется электронным устройством. Каждая крыса проходила тест фон Фрея один раз в 3-4 дня на протяжении 19 дней, как указано выше. В каждый день измерений каждое животное проходило 5 тестов на каждую заднюю лапу.

Статистика

Все эксперименты проводились на 3-4 животных на условие (повторы и образцы/когорты). Для одностороннего анализа ANOVA с коррекцией Данна-Сидака и двустороннего анализа ANOVA с коррекцией Туки применялось программное обеспечение Prism (GraphPad Software, Ла-Хойя, Калифорния, США). Для тестирования значимости отличий между условиями применялся непарный t-критерий Стьюдента.

Иммуногистохимия

Нервные ткани мы закрепили 4%-ным раствором параформальдегида (PFA; Bio lab, Иерусалим, Израиль), дегидрировали в возрастающих концентрациях этилового спирта и ксилена, залили парафином и рассекли на срезы по 5 мкм. После депарафинизации и регидратации срезов мы инкубировали их для демаскировки антигенов с 0,01 М цитрата натрия ddH2O, pH 6.0, после чего обильно промыли ddH2O и блокировали 10%-ной нормальной сывороткой козла (Jackson Laboratory, Бар-Харбор, Мэн, Соединенные Штаты) с PBS с содержанием 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA; Sigma-Aldrich, Ревохот, Израиль).

Мы инкубировали срезы на ночь при комнатной температуре в камере с увлажненным воздухом либо с кроличьим поликлональным антителом к тяжелым полипептидным цепям нейрофиламентов (Abcam, Zotal, Тель-Авив, Израиль) (разведенным в пропорции 1:200), либо с мышиным моноклональным антителом к основному белку миелина (Abcam, Zotal, Тель-Авив, Израиль) (разведенным в пропорции 1:200). Вторичные антитела Alexa goat anti-mouse 594 и goat anti-rabbit 488 (Invitrogen, Rhenium, Модиин-Маккабим-Реут, Израиль), разведенные в пропорции 1:750, использовались в качестве вторичных антител и инкубировались в течение 1 ч.

Мы промыли срезы PBS и залили их гистологической средой DAPI Fluoromount G (SouthernBiotech, Бирмингем, Алабама, Соединенные Штаты). Отрицательные контрольные срезы инкубировались только с вторичными антителами и только с одним первичным антителом, затем – с обоими вторичными антителами в рамках экспериментов с двойным IF окрашиванием. Визуализация производилась при помощи конфокального микроскопа Olympus FV3000 с объективом UCPLFLN x 20/0.7 NA. Для захвата изображения и анализа применялось программное обеспечение FLUOVIEW.

Выводы

Потенциал TENG как инструмента для получения биомеханической энергии широко обсуждался в научных работах, и авторы опубликованных исследований коснулись потенциала TENG как инструмента обеспечения осязания. В представленной работе мы продемонстрировали принцип действия in vitro и in vivo и способность технологии TENG функционировать в виде простого, настраиваемого, недорогого и самопитаемого устройства для восстановления осязания, со сравнительно небольшим числом компонентов и несложным производственным процессом.

При условии доработки до полной реализации своего потенциала TENG-IT может в конечном итоге предоставить пациентам возможность восстановить осязание без внешнего источника электропитания и недостатков, характерных для существующих нейропротезов.

Другие актуальные исследования:

Дата публикации: 26.07.2021