Израильские ученые провели исследование, которое пролило свет на то, как коронавирус воздействует на организм человека и какие клетки при этом повреждает. Результаты работы дают возможность предложить пациентам новое лечение, которое позволит быстрее восстанавливаться и предупреждать возникновение осложнений.
Авторы исследования: Хадар Медини, Амит Зирман, Дэн Мишмар (Университет Бен-Гуриона, Израиль).
Введение
У значительного числа пациентов с COVID-19 развиваются тяжелые, смертельные осложнения инфекции дыхательных путей, объясняемые критическими воспалительными явлениями под общим названием «цитокиновый шторм». Это воспалительное состояние связано с разрушительным окислительным стрессом. Оно, как и повышенная выработка реактивных форм кислорода (РФК), указывает на изменения в митохондриальной активности.
Данный вывод подкрепляют наблюдения, согласно которым митохондрии играют ключевую роль в модуляции активности врожденного иммунитета. В частности, после распознавания вирусных геномов врожденным иммунитетом рецепторы генов, схожих с геном I, индуцируемым ретиноевой кислотой (RIG-I; RLR), RIG-I и MDA5 вступают во взаимодействие с митохондриальным противовирусным сигнальным белком (MAVS). MAVS, в свою очередь, активирует каскад внутриклеточной сигнализации, который индуцирует транскрипцию генов, кодирующих интерфероны I типа.
Несколько наборов данных подчеркивают, что митохондрии являются ключевой клеточной мишенью при инфекции SARS-CoV-2.
- Во-первых, эксперты обнаружили существенные сходства в последовательностях SARS-CoV-2-кодированных белков и митохондриально-локализованных белков, кодированных SARS-CoV-1 (3/29 генов, кодирующих белки). Эти сходства доказанно влияют на митохондриальную генную экспрессию и компоненты врожденного иммунитета.
- Во-вторых, недавний обширный вычислительный анализ спрогнозировал преференциальную митохондриальную локализацию РНК и sgРНК SARS-CoV-2, а результаты экспериментов выявили взаимодействие SARS-CoV-2-кодированных белков с митохондриями.
- В-третьих, недавнее исследование позволило обнаружить изменения в митохондриальной динамике у пациентов с COVID-19, связанное с повышенным слиянием и ингибированием митохондриального расщепления.
Таким образом, вероятно, что при инфекции SARS-CoV-2 происходит захват и изменение митохондриальной функции. Хотя известно, что митохондрии выполняют регуляторную функцию в иммунной системе, регуляторный ответ митохондрий на инфекцию SARS-CoV-2 практически не изучался. По результатам недавно проведенного секвенирования РНК в клинических образцах дыхательных путей и клеточных линиях, ассоциированных с легкими, выяснилось, что митохондриальная генная экспрессия при инфекции SARS-CoV-2 почти не претерпела изменений ни в митохондриальном геноме (мтДНК), ни в ядре. Об этих результатах стало известно во время нашей научной работы.
На основании таких данных можно заключить, что COVID-19 не оказывает существенного влияния на митохондриальную генную экспрессию и последующую митохондриальную активность. Тем не менее, полученные результаты не исключают возможного регуляторного ответа митохондрий на инфекцию SARS-CoV-2 в зависимости от типа ткани или клеток.
В рамках представленной работы мы проанализировали результаты секвенирования РНК как множества, так и одиночных клеток у пациентов с COVID-19 в сравнении с контрольной группой и обнаружили существенное снижение уровней генной экспрессии мтДНК в образцах крови при противоречивых изменениях в образцах ткани, взятых из дыхательных путей. Этому наблюдению соответствуют и результаты секвенирования РНК одиночных клеток, из которых видно, что изменения в генной экспрессии мтДНК преимущественно происходят в клетках иммунной системы, в то время как в эпителиальных клетках дыхательных путей в основном обнаруживаются менее заметные изменения.
Реакция связанных с митохондриями путей в ядре (включая выработку РФК, трикарбоновую кислоту [ТКК], гликолиз) рассматривается в свете явной зависимости репликации SARS-CoV-2 от гликолиза, вероятно за счет митохондриального окислительного фосфорилирования (OXPHOS). Наши результаты подчеркивают негативное влияние COVID-19 на регуляцию митохондриальной генной экспрессии в зависимости от типа ткани и типа клеток.
Ход исследования
Наши результаты указывают на снижение мтДНК-кодированной генной экспрессии в ответ на инфекцию SARS-CoV-2 в зависимости от типа ткани и типа клеток.
- Во-первых, общее секвенирование РНК образцов периферической и цельной крови выявило такое снижение – в отличие от образцов из дыхательных путей, в которых данной тенденции не наблюдалось.
- Во-вторых, секвенирование РНК одиночных клеток позволило обнаружить снижение уровней генной экспрессии мтДНК в нескольких проанализированных клетках иммунной системы – в сравнении с незначительным снижением генной экспрессии мтДНК в эпителиальных клетках дыхательных путей и полным отсутствием такого снижения.
Полученные результаты подтверждают существование различий в зависимости от типа клеток и ткани в масштабе регуляторного эффекта на митохондриальную генную экспрессию у больных COVID-19. Мы склонны интерпретировать эти результаты как частичное объяснение явного отсутствия изменений в генной экспрессии мтДНК в дыхательных путях по результатам общего секвенирования РНК: менее явные различия в генной экспрессии мтДНК в эпителиальных клетках (как и в некоторых клетках иммунной системы, изолированных из дыхательных путей) могут замаскировать отличия в генной экспрессии мтДНК в дыхательных путях, но не в крови.
Так как два из пяти наборов данных, проанализированных методом общего секвенирования РНК, происходят от двух разных платформ секвенирования, различия во влиянии на генную экспрессию мтДНК можно отнести на счет разных типов ткани, хотя вариации в методах сбора образцов и/или платформах секвенирования также нельзя исключать. Еще одним параметром, способным повлиять на различия в генной экспрессии в митохондриях, выступает генетическое происхождение мтДНК (гаплогруппа). Таким образом, исследование влияния гаплогрупп на различия в генной экспрессии между здоровыми и инфицированными образцами начнет представлять научный интерес после того, как станут доступны более крупные выборки.
Мы предположили, что снижение генной экспрессии мтДНК в образцах, взятых у больных COVID-19, вызвана общим изменением в корегуляции генов окислительного фосфорилирования. Общая тенденция к повышению экспрессии в ядерных ДНК-кодированных генах OXPHOS у пациентов с COVID-19 поддерживает нашу гипотезу, так как по большому счету в здоровых человеческих тканях наблюдается положительная коэкспрессия митохондриальных и нуклеарных ДНК-кодированных компонентов механизма OXPHOS. Из этого можно вывести две возможные интерпретации: изменения в координации митохондриально-нуклеарной генной экспрессии у больных COVID-19 (A) отражают нарушения в митохондриально-нуклеарной корегуляции и/или (B) контролируют перенастройку механизма OXPHOS на гликолиз.
И действительно: мы обнаружили, что у больных COVID-19 наблюдается общее повышение экспрессии генов, кодирующих ферменты гликолиза, а также снижение экспрессии LDHB и повышение экспрессии LDHA. Это не противоречит наблюдаемой зависимости репликации SARS-CoV-2 в моноцитах от активного гликолиза, из чего можно сделать вывод о том, что дисфункция OXPHOS у больных COVID-19 в первую очередь обеспечивает генерацию гликолитической среды, способствующей цитокиновому шторму. Эту интерпретацию подкрепляют наши наблюдения касательно повышения экспрессии генов, вовлеченных в путь IFN, и повышения экспрессии генов в RIG-I-образных рецепторах и пути MAVS, ранее отмеченного в других работах. Последнее может привести к активации сигнального каскада, положительно индуцирующего гены, кодирующие интерфероны I типа.
Мы полагаем, что наблюдаемое нами стойкое изменение в генной экспрессии мтДНК и связанных с нею путях приводит к вирус-индуцированному цитокиновому шторму и, соответственно, представляет собой фундаментальное явление в этиологии заболевания. Тестирование на эту возможность требует проведения эксперимента с контролем динамики в клетках (предпочтительно относящихся к иммунной системе) с оценкой генной экспрессии через определенные временные интервалы после инфекции SARS-CoV-2.
Мы отметили, что в клетках и тканях со стойкими значительными различиями в митохондриальной генной экспрессии между пациентами и контрольной группой (по меньшей мере в двух независимых наборах данных) наблюдается снижение генной экспрессии мтДНК у пациентов (по итогам как общего секвенирования РНК, так и секвенирования РНК одиночных клеток) вне зависимости от различий в участках сбора образцов и используемых платформах секвенирования.
И напротив: повышение генной экспрессии мтДНК у пациентов носило противоречивый характер и зависело от баз данных. Это наблюдение указывает на то, что SARS-CoV-2 влияет на митохондриальную регуляцию в разных клетках приблизительно одинаково. Тем не менее, хотя направленность эффекта носит стойкий характер (например, снижение экспрессии мтДНК у больных COVID-19), регуляторный феномен зависит от типа клеток. Отсюда возникает интересный вопрос о том, какую роль играют пораженные типы клеток в этиологии заболевания.
Как упоминалось выше, наши результаты указывают на то, что значительное снижение генной экспрессии мтДНК обнаруживается по итогам общего секвенирования РНК образцов крови, а не тканей дыхательных путей. Помимо состава клеток разных типов и различий между этими двумя видами образцов следует также учитывать, что в крови обнаружились внеклеточные цельные, активные митохондрии. Соответственно, было бы интересно измерить число внеклеточных митохондрий в образцах крови и тканей дыхательных путей, взятых у больных COVID-19 и участников исследования из контрольной группы, и изучить их транскрипционные сигнатуры. В результате мы, скорее всего, сможем выйти на новый уровень понимания изменений в паттернах митохондриальной генной экспрессии у больных COVID-19.
Чтобы выявить первые признаки механизма, потенциально лежащего в основе снижения генной экспрессии мтДНК у больных COVID-19, мы приступили к поиску гена-кандидата и связи между измененной генной экспрессией мтДНК и известными регуляторами транскрипции, посттранскрипции и репликации мтДНК. Судя по полученным результатам, в образцах периферической и цельной крови пациентов снижение генной экспрессии мтДНК ассоциируется со снижением экспрессии митохондриальной РНК-полимеразы (POLRMT), а также повышенной экспрессией c-Jun и сниженной экспрессией JunD. Снижение экспрессии POLRMT представляет собой простое объяснение снижения генной экспрессии мтДНК в периферической крови пациентов, однако данное наблюдение не получило однозначного подтверждения по итогам секвенирования РНК одиночных клеток.
Примечательно, что в отличие от POLRMT, измененная экспрессия c-Jun и JunD постоянно наблюдалась в наборах данных по итогам как общего секвенирования РНК, так и секвенирования РНК одиночных клеток. К примеру, экспрессия c-Jun повышалась, а JunD – снижалась в клетках тех типов, в которых отмечалось существенное снижение генной экспрессии мтДНК. Это в особенности привлекло наше внимание, так как в определенных клеточных линиях наблюдалось связывание c-Jun и JunD в человеческой мтДНК, потенциально свидетельствующее об их участии в регуляции транскрипции мтДНК.
Обнаруженная нами связь между изменениями экспрессии c-Jun и JunD в образцах, взятых у пациентов, подразумевает, что они действуют соответственно как репрессор и активатор генной экспрессии мтДНК – и что данный эффект индуцируется в организме пациента. Так как c-Jun и JunD хорошо известны своими регуляторными мишенями в ядре, было бы чрезвычайно интересно экспериментально оценить механизм их действия в митохондриях, вероятное участие в митохондриально-нуклеарной корегуляции и возможное изменение их митохондриальной локализации в ответ на инфекцию SARS-CoV-2.
Рассматривая далее механизм, согласно которому генная экспрессия мтДНК даун-регулируется у больных COVID-19, следует учитывать дополнительные факторы, включая микроРНК. Действительно: по недавним результатам произведенного на основе Генной онтологии секвенирования микроРНК периферической крови пациентов с COVID-19 в образцах обнаружились изменения в экспрессии микроРНК, воздействующих на гены, ассоциированные с митохондриальным матриксом.
Более того: анализ дифференциальной экспрессии микроРНК в плазме крови позволил обнаружить, что уровни экспрессии hsa-miR-542-5p (микроРНК, которая, по всей вероятности, колокализуется с человеческими митохондриями и ранее ассоциировалась с митохондриальной дисфункцией) у больных COVID-19 существенно снижены. Наконец, экспрессия hsa-miR-483-5p, связывающей и репрессирующей активность FIS1, ключевого компонента митохондриального деления, оказалась существенно повышенной у больных COVID-19, получавших дополнительный кислород. Таким образом, в дальнейшем можно исследовать роль митохондриально-направленных микроРНК в регуляции мтДНК в целом и при COVID-19 в частности.
Помимо наблюдаемого снижения экспрессии митохондриальных генов мы выявили повышение экспрессии нескольких генов, участвующих в пути ответа IFN1. Это примечательный результат, так как ранее эксперты уже продемонстрировали, что лечение клеток млекопитающих интерферонами приводит к снижению генной экспрессии мтДНК. Это свидетельствует о возможном регуляторном воздействии интерферона на транскрипты мтДНК, потенциально объясняющем связь между клеточным ответом на инфекцию SARS-CoV-2 и изменениями в митохондриальной регуляции.
Так как наши результаты указывают на то, что такие изменения зависят от типа клеток и наиболее очевидны в клетках иммунной системы, неудивительно, что прошлые анализы (легочных) эпителиальных клеток после инфекции SARS-CoV-2 выявили достаточно низкий ответ интерферона I и III типов вместе с неоднозначными изменениями в генной экспрессии мтДНК. Таким образом, немалый потенциал кроется в дальнейшем тщательном изучении механизмов, отвечающих за модулирование регуляции митохондриальной генной экспрессии интерферонами.
В целом, мы наблюдали снижение уровней генной экспрессии мтДНК в клетках различных типов, но в первую очередь в клетках иммунной системы вне зависимости от того, откуда производился забор: из крови или из тканей дыхательных путей. Это наблюдение вкупе с явными обратными изменениями генной экспрессии в нуклеарно-кодированных генах OXPHOS у больных COVID-19 указывает на отход от регуляции коэкспрессии митохондриальных и нуклеарных геномов.
Такая интерпретация способна объяснить повышение экспрессии генов, участвующих в выработке РФК и потенциально отражающих клеточный ответ на митохондриальную дисфункцию. Это изменение сопровождается повышением экспрессии гликолитических ферментов, в особенности LDHA, и снижением экспрессии LDHB. Судя по данным наблюдениям, при инфекции SARS-CoV-2 клетки (в особенности относящиеся к иммунной системе) перенастраиваются на гликолиз.
Анализ генной экспрессии мтДНК у уникальной группы пациентов, предоставивших образцы во время прогрессирования COVID-19, указывает на то, что снижение генной экспрессии мтДНК обратимо после выздоровления. Таким образом, возможно, что восстановление митохондриальной функции служит прогностическим фактором более благоприятного состояния больных COVID-19 и тем самым подчеркивает, что митохондрии являются важной мишенью для медикаментозной терапии с целью улучшения состояния пациентов.
Результаты
Наша работа основана на анализе генной экспрессии на уровне РНК. Тем не менее, вариабельность экспрессии у больных COVID-19 может наблюдаться и на белковом уровне. Данное явление представляет интерес, но не рассматривается в рамках секвенирования РНК.
Кроме того, анализ результатов секвенирования РНК, соответствующий уровням РНК в стабильном состоянии, не способен выявить, что именно служит причиной наблюдаемых изменений в митохондриальной генной экспрессии у больных COVID-19: регуляция транскрипции, распад РНК или и то, и другое. Мы определили возможные пути решения данной проблемы путем наблюдения взаимосвязей между изменениями в митохондриальной генной экспрессии и потенциальными регуляторами митохондриальной транскрипции (POLRMT, c-Jun и JunD). Эти взаимосвязи необходимо рассматривать с осторожностью до тех пор, пока они не получат подтверждение по результатам экспериментов.
