Биомиметические наночастицы как лечебно-диагностический инструмент при травматических повреждениях головного мозга

Ученые создали новую нанотехнологию для лечения травм головного мозга.

Исследователи из университета Технион совместно с коллегами из США разработали уникальную технологию с использованием биометрических наночастиц, которая поможет лечить наследственные и дегенеративные заболевания головного мозга, а также травмы головы. Результаты исследования попали на обложку журнала Advanced Science.

Авторы исследования: Асаф Зингер, Сирена Сориано, Герардо Баудо, Энрике Де Роса, Франческа Тарабалли, Соня Виллапол (Хьюстонский методистский академический институт, Техас, США).

Введение

Травматические повреждения головного мозга (ТПГМ) – это серьезная проблема. Ее актуальность постепенно возрастает. На ТПГМ приходится приблизительно 2,5 миллиона посещений отделений неотложной медицинской помощи, 56 000 смертей в год и свыше 60 миллиардов долларов прямых медицинских расходов на паллиативную терапию и когнитивную реабилитацию.

Сразу же после травмы разрушается гематоэнцефалический барьер и активируется нейровоспалительный каскад, вызывающий дегенерацию тканей мозга. К типичным патологическим последствиям ТПГМ относятся гематома, субарахноидальное кровоизлияние, нейровоспаление и аксональное повреждение. Большинство таких повреждений головного мозга, в свою очередь, приводят к долгосрочным физическим, эмоциональным и когнитивным последствиям. Вместе с тем, несмотря на значительную угрозу для общественного здравоохранения, эффективной фармакотерапии, показанной при ТПГМ, не существует.

Доступ к головному мозгу из периферии в основном регулируется гематоэнцефалическим барьером – существенным препятствием на пути малых молекул и макромолекул, стремящихся проникнуть в мозг. В нейровоспалении участвует несколько молекулярных и клеточных медиаторов, включая активацию резидентной микроглии и выброс воспалительных цитокинов и хемокинов в области травмы. Примечательно, что после ТПГМ развивается не только нейровоспаление: как мы уже продемонстрировали на примере мышиной модели ТПГМ при изучении воспаления печени, наблюдается и поражение периферических органов вследствие посттравматического системного воспаления.

В прошлых исследованиях изучалось центральное воспаление без учета иммунных клеток, мигрирующих из периферии и играющих важную роль в усугублении повреждений головного мозга. После ТПГМ механическое повреждение незамедлительно разрывает гематоэнцефалический барьер, вызывая излияние белков плазмы, лейкоцитов, T-клеток, моноцитов или макрофагов, способствующих нейровоспалению, нейротоксичности, гибели нейронов и увеличению масштаба повреждения головного мозга. Точнее, быстрая инвазия воспалительных лейкоцитов (CD11b+/CD45+) в область травмы приводит к усугублению нейропатологии с активацией резидентной микроглии и макрофагов после ТПГМ.

Как нам и другим исследователям уже довелось наблюдать, активированные периферические иммунные клетки и тромбоциты мобилизуются через сосудистую сеть головного мозга, проникая в его паренхиму после индуцированного повреждения. Это периферическое воспаление после ТПГМ влияет на многие органы и выражается в местном воспалении и повреждении печени, сердца, легких, селезенки, кишечника и микробиома кишечника. Периферический воспалительный эффект необходимо изучать параллельно с ТПГМ. Соответственно, в представленной работе мы исследуем инфильтрационный потенциал наночастиц в периферических органах, способных пострадать в результате ТПГМ.

Известно, что снижение воспаления в острой фазе уменьшает хроническое воспаление в моделях ТПГМ и что часть этого воспаления идет из периферии. Таким образом, для восстановления поврежденного головного мозга необходимо уменьшить центральное и периферическое воспаление. Преходящий разрыв гематоэнцефалического барьера после ТПГМ повышает проницаемость в периконтузионной зоне и потенциально обеспечивает уникальную возможность доставки лекарственных препаратов.

Применение технологии наночастиц позволяет воспользоваться новыми возможностями в лечении поврежденного головного мозга. Наночастицы применяются в качестве транспортного средства для лекарственных препаратов при различных заболеваниях. В последние несколько лет наномедицина также применяется в лечении патологий головного мозга. За последние десятилетия эксперты разработали несколько нанопрепаратов для улучшения растворимости и фармакокинетики разных лекарств с тем, чтобы лекарства обладали более таргетным действием и вызывали меньше побочных эффектов. Вместе с тем нанопрепараты против патологий головного мозга сталкиваются с многочисленными биологическими препятствиями, включая их неспособность пересечь гематоэнцефалический барьер, поглощение системой мононуклеарных фагоцитов, уничтожение клетками Купфера в печени и фильтрацию в почечных клубочках до достижения таргетной зоны.

Биомиметические стратегии позволили изменить парадигму в разработке наночастиц и создать платформы нового поколения для взаимодействия с комплексными биологическими системами и эффективного влияния на их поведение. Наша группа недавно разработала инновационный биомиметический препарат, имитирующий клеточную мембрану лейкоцитов в отношении ее липидного (липосомы [Lipo]) и белкового (лейкосомы [Leuko]) составов. В частности, Leuko воздействует на активированный эндотелий через CD11b и избегает поглощения мононуклеарной фагоцитарной системой (МФС) через CD45. И CD11b, и CD45 присутствуют на поверхности Leuko.

Более того: Leuko преодолевает разрыв между синтетическими наночастицами (т.е., Lipo) и нативными клетками (т.е., иммунными клетками) и значительно совершенствуют текущую парадигму таргетирования и защиты наночастиц, которая до сих пор основывалась исключительно на синтетических маршрутах. Ранее мы также выявили половые различия в воспалительном ответе с использованием той же модели ТПГМ.

Дополнительные исследования подчеркнули необходимость рассматривать пол как биологическую переменную после ТПГМ, в особенности в контексте любой терапии, модифицирующей воспалительный ответ в женском или мужском организме. В рамках нашего исследования мы изучаем, как пол влияет на результаты терапии после травмы. Полученные данные необходимо использовать в разработке более эффективного лечения ТПГМ в соответствии с полом пациента.

В представленной работе мы вначале охарактеризовали физико-химические и биомиметические свойства Leuko и Lipo. Затем мы оценили способность этих двух групп наночастиц воздействовать на поврежденные ткани головного мозга и периферические органы в рамках более системного подхода с учетом пола в мышиной модели ТПГМ. Наконец, мы изучили изменения воспалительного ответа и области поражения, а также инфильтрации макрофагов после ТПГМ. Таким образом, наши результаты указывают на то, что наночастицы можно использовать в качестве полезного лечебно-диагностического инструмента для воздействия на поврежденный головной мозг и воспаленные органы, пострадавшие в результате ТПГМ.

Ход исследования

Создание липосом и лейкосом

Процессы создания наночастиц Lipo и Leuko отличаются друг от друга одним этапом: добавлением мембранного белка лейкоцитов во время регидратации тонкой пленки липидов. Как сообщалось в нашей предыдущей работе, мы тщательно охарактеризовали физико-химические и биомиметические свойства Lipo и Leuko. Наконец, мы систематически ввели наночастицы после ТПГМ с тем, чтобы проанализировать скопление наночастиц в разных органах через 24 часа после ТПГМ.

Мы подтвердили, что добавление 0.058 мг/мл-1 мембранных белков лейкоцитов в процессе создания наночастиц не повлияло на их размер или коэффициент полидисперсности (КПД). Вместе с тем мы также отметили, что после интеграции мембранных белков в мембрану Leuko заряд поверхности (т.е., дзета-потенциал [ДП]) снизился в 1,7 раз по сравнению с группой Lipo.

Далее мы получили снимки Lipo и Leuko, произведенные методом трансмиссионной электронной криомикроскопии. По снимкам в обеих группах обнаружилась аналогичная двухслойная структурная морфология, свидетельствующая о том, что интеграция белка не повлияла на морфологию наночастиц. Затем мы подтвердили наличие уникальных лейкоцитарных белков после создания наночастиц. Четыре маркера лейкоцитарных мембранных белков, необходимых для таргетирования лейкоцитарного воспаления (т.е., CD11b, CD18, CD45 и CD47), обнаружились по результатам вестерн-блоттинга в группе Leuko, но не обнаружились в группе Lipo.

После создания наночастиц и описания их характеристик по стандартному протоколу мы продемонстрировали создание Lipo и Leuko в воспроизводимом виде. Наконец, мы определили, что мембранные белки лейкоцитов интегрировались в оба слоя наночастиц, не абсорбировались снаружи и не закреплялись внутри по нескольким причинам:

Абсорбция белков на поверхности наночастиц повлияла бы на размер и морфологию наночастиц;
Сниженный дзета-потенциал подтвердил наличие мембранного белка на поверхности наночастиц;
Неинтегрированные белки отделились бы во время фазы очищения при диализе.

В дальнейшем мы также протестировали четыре лейкоцитарных рецептора, чтобы доказать: эти белки присутствуют в группе Leuko и отсутствуют в группе Lipo. Наличие таких белков в группе Leuko требуется для обеспечения их уникальной естественной биологической активности, релевантной и для воспаления, и для обхода мононуклеарной фагоцитарной системы в контексте ТПГМ. CD11b и CD18 – это две субъединицы CD11-рецептора, вовлеченного в обеспечение адгезии и в соответствующие связи между такими воспалительными клетками, как моноциты, макрофаги, естественные киллеры и гранулоциты. Тем не менее, он также явно присутствует на активированной микроглии во время нейродегенерации. Соответственно, наличие таких рецепторов в группе Leuko должно усовершенствовать таргетирование, обеспечить взаимодействие с иммунной нишей травмы и предупредить (совместно с CD45 и CD47) фагоцитоз со стороны МФС.

Таргетирование поврежденного головного мозга наночастицами in vivo

Чтобы изучить таргетирование поврежденного головного мозга наночастицами после их системного введения in vivo, мы добавили одинаковый объем флуоресцентного липида Cy5.5-1,2-дистеароил-sn-глицерол-3-фосфорилэтаноламина (DSPE, Avanti; 0,05 мкл на 1 мл нанопрепарата) к наночастицам во время создания групп Lipo и Leuko. Несмотря на добавление флуоресцентного липида в одном и том же объеме к каждому нанопрепарату, флуоресценция Lipo превзошла флуоресценцию Leuko в 1,1 раза. Данный фактор учитывался при количественной оценке биодистрибуции наночастиц in vivo.

Разную интенсивность флуоресценции можно объяснить тем фактом, что флуорофор Cy5.5 конъюгирует с DSPE-липидом, облегчающим его интеграцию в гидрофобную зону мембраны наночастиц. Таким образом, лейкоцитарные белки в той же области могут препятствовать интеграции флуоресцентного липида. В результате в мембрану Leuko интегрировалось меньше флуоресцентных липидов, что привело к снижению интенсивности флуоресценции.

Для создания модели ТПГМ, мы нанесли травмы мышам обоего пола, вызвав повреждения головного мозга средней или тяжелой степени в соматосенсорной коре правого полушария. Вскоре после этого мы ретроорбитально ввели мышам забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS, т.е., транспортное вещество [Vh]), Lipo либо Leuko. Спустя 24 часа мы сделали снимки животных под анестезией. На снимках обнаружилось скопление наночастиц только в головном мозге мышей с ТПГМ обоего пола, получивших наночастицы. В частности, наночастицы могут достичь головного мозга только в случае разрыва гематоэнцефалического барьера после ТПГМ (т.е., механического повреждения), поэтому флуоресцентные наночастицы потенциально могут служить диагностическим инструментом.

Наша мышиная модель ТПГМ демонстрирует воспроизводимые острые аспекты фокальной травмы головного мозга, включая разрыв гематоэнцефалического барьера и активацию вторичных травматических процессов вследствие воспаления. Более того: ТПГМ повышает проницаемость сосудистой сети головного мозга в области травмы. Схожая сосудистая сеть с высокой проницаемостью образуется и в солидной опухоли. Таким образом, мы ожидали пассивного скопления обоих нанопрепаратов в области травмы, наблюдавшегося в рамках других работ, посвященных ТПГМ.

Тем не менее, значительно более усовершенствованное таргетирование головного мозга наночастицами Leuko в сравнении с Lipo может быть обусловлено различными факторами. Например, воспаленный эндотелий, окружающий область травмы, вероятно, улучшает таргетирование Leuko, что подтверждается моделями местного и опухолевого воспаления.

Примечательно, что анализ при помощи нашей системы визуализации in vivo (IVIS) выявил скопление наночастиц в области повреждения в обеих группах спустя 24 часа после травмы без признаков диффузии наночастиц в другие участки головного мозга. Более того: мы не обнаружили различий в таргетировании головного мозга наночастицами при сравнении головного мозга мужских и женских особей ex vivo в каждой группе наночастиц.

Важно отметить, что статистически значимое повышение скопления Leuko (в 1,5 раза) в головном мозге по сравнению с Lipo наблюдалось в женских моделях ТПГМ. Что касается мужских особей, мы зафиксировали незначительную разницу в поглощении Leuko (в 1,3 раза) по сравнению с Lipo. Отсутствие существенных различий в мужских группах, получивших наночастицы, можно объяснить низким разрешением снимков IVIS. Флуоресценция, зафиксированная IVIS, поступала от целого органа (т.е., ткани и кровеносных сосудов), а не только от зон воспаленного эндотелия.

Биодистрибуция органов, фильтрующих наночастицы, после ТПГМ

Чтобы определить, влияет ли добавление мембранных белков лейкоцитов к наночастицам на их биодистрибуцию in vivo после ТПГМ, мы произвели сбор фильтрующих органов мышей (напр., легких, селезенки, почек и печени) и измерили флуоресценцию наночастиц в этих органах ex vivo с помощью IVIS. Самый высокий флуоресцентный сигнал был зафиксирован в печени. За ней следовали селезенка, почки и легкие.

Впоследствии, чтобы проверить переносимость Leuko и Lipo in vivo, мы собрали, промыли, стабилизировали, рассекли и окрасили вышеперечисленные органы гематоксилином и эозином (H&E) для оценки повреждений ткани. Различий в аномальной или патологической морфологии в органах из двух групп наночастиц в сравнении с тканями контрольной мыши, получившей инъекцию PBS, не обнаружилось. Не удалось выявить и существенных половых различий. Тем не менее, мы отметили общее сравнительно низкое скопление наночастиц в легких. Данное явление прогнозировалось в связи с маленьким размером наночастиц (<200 нм). Примечательно, что в предыдущих докладах не исследовалась дифференциальная биодистрибуция между группами ТПГМ и контроля. Тем не менее, эксперты предположили, что ТПГМ также индуцирует изменения в циркулирующей крови и периферических органах.

Несмотря на то, что это новая область исследований, интересно отметить, что наночастицы скапливаются в фильтрующих органах группы ТПГМ, но не в группе контроля. В связи с этим наблюдением возникает множество вопросов. Мы полагаем, что скопление наночастиц происходит в связи с усиленным выведением отходов, в особенности почками, после травмы; данный феномен мог бы объяснить скопление наночастиц в почках и требует подтверждения в других моделях ТПГМ. К сожалению, в предыдущих исследованиях данная информация преимущественно считалась вторичной. Существует множество возможностей, но они не входят в задачи представленной работы. И все же эту вторичную мишень можно использовать в рамках будущих стратегий против периферического воспаления, направленных на лечение ТПГМ как системной патологии, а не только как воспаления головного мозга.

Наночастицы в головном мозге и их дистрибуция в сосудах мозга после ТПГМ

Чтобы дополнительно изучить специфическую область таргетирования в обеих группах наночастиц, мы использовали метод интравитальной микроскопии (IVM) и сфокусировались на отдельных участках головного мозга in vivo. В частности, мы изучили сосудистую сеть головного мозга сразу же и спустя 24 часа после введения наночастиц. Данный анализ подтвердил качественно более высокое таргетирование воспаленного эндотелия наночастицами Leuko; ранее нашей группе уже доводилось наблюдать такое явление в моделях различных заболеваний.

Мы также отметили, что таргетирование Leuko направлено на стенки кровеносных сосудов и поглощается окружающими тканями головного мозга. И напротив: нам не удалось дать качественную оценку диффузии наночастиц в неповрежденных тканях головного мозга. На основании этого факта можно предположить, что явления парацеллюлярной диффузии, схожие с тем, что наблюдается в случае Leuko, ограничены областью, окружающей зону травмы, по меньшей мере на 24 часа (т.е., на время, прошедшее после введения наночастиц).

Данное наблюдение подтвердилось и по результатам иммунофлуоресцентного окрашивания. Здесь мы также не выявили половых различий в группах наночастиц. Вместе с тем Leuko эффективнее воздействовали на область травмы в женской группе по сравнению с Lipo – возможно, в связи с более эффективным воспалительным ответом после травмы головного мозга у женских особей в сравнении с мужскими, как сообщили Виллапол и соавторы.

Наночастицы модулируют нейровоспалительный ответ после ТПГМ

Для количественной оценки мы сфокусировались на области первичной соматосенсорной коры, непосредственно прилегающей к зоне повреждения. Мы обнаружили, что ТПГМ у мужских особей, получивших наночастицы, вызвало быстрое увеличение количества Iba-1-положительных клеток спустя 24 часа после травмы. Существенные различия наблюдались и у Lipo-мужских, и у Leuko-женских особей в сравнении с соответствующими Vh-моделями. Увеличение количества Iba-1-положительных клеток может быть связано с увеличением объема защитной и восстанавливающей микроглии, способной усилить защитную функцию наночастиц, но для определения этого процесса необходимо провести дополнительные исследования. Возможно, скопление местной микроглии непосредственно индуцируется наличием наночастиц в области повреждения, хотя данный вопрос еще не изучался.

ТПГМ индуцирует быструю инфильтрацию головного мозга периферическими иммунными клетками из крови в острой стадии. F4/80 – это хорошо изученный мембранный белок, и он активно экспрессируется на макрофагах с целью быстрой инфильтрации поврежденной коры после ТПГМ. В группах наночастиц обнаружилось снижение уровня F4/80-положительных клеток в поврежденной коре в сравнении с Vh-группами через 24 часа после ТПГМ. Уменьшение периферического воспаления в связи с введением наночастиц можно отнести на счет системного эффекта нанопрепарата и возможного следствия блокады воспалительного ответа периферическими органами с соответствующим снижением инфильтрации макрофагов.

Снижение уровня инфильтрирующих воспалительных клеток недавно отмечалось и при другом иммуномодулирующем подходе к лечению ТПГМ. Кроме того, инъекции наночастиц, содержащих регулирующие воспаление miR-146a, в головной мозг сразу же после экспериментального ТПГМ значительно снизили уровни гиппокампального ФНО-рецептор-ассоциированного фактора-6 и интерлейкин-1-рецептор-ассоциированной киназы-1. Таким образом, потенциальный механизм контроля нейровоспалительного ответа наночастицами, скорее всего, не зависит от физико-химических переменных.

Наночастицы уменьшают площадь поражения и улучшают двигательную способность

Чтобы исследовать терапевтическое действие наночастиц в острой стадии после ТПГМ, мы измерили площадь поражения при ТПГМ. Мы обнаружили, что масштаб поражения уменьшился приблизительно на 28,6% у мужских особей, получивших наночастицы, и примерно на 21,6% у женских особей, получивших наночастицы, по сравнению с Vh-моделями (n=5 для всех групп).

Несколько моделей ТПГМ продемонстрировали функциональные улучшения после терапии с использованием наночастиц. Например, наночастицы с дексаметазоном оказались эффективным средством лечения после ТПГМ. Такая терапия наночастицами не только повысила показатели выживаемости, но и уменьшила тревожность, апоптоз и разрыв гематоэнцефалического барьера в экспериментальных группах животных.

Кроме того, в рамках представленной работы мы оценили двигательную способность мышей после ТПГМ, используя тест «вращающийся стержень» после введения наночастиц. Наши результаты указывают на то, что вне зависимости от пола результаты функционального теста на двигательную способность существенно улучшились в группе Lipo в сравнении с Vh-моделями.

Выводы

В представленной работе мы продемонстрировали возможность использования биомиметических наночастиц в качестве лечебно-диагностического инструмента при ТПГМ. Мы разработали инновационную систему доставки препаратов, которая:

Проникает в поврежденный головной мозг, транспортируя при этом флуоресцентное вещество, воздействующее на местное воспаление в мозге;
Может использоваться в качестве инструмента диагностики при подозрении на разрыв гематоэнцефалического барьера;
Уменьшает площадь поражения.

Примечательно, что флуоресцентный маркер наночастиц можно заменить контрастирующим средством 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-диэтилентриаминпентауксусной кислотой (гадолиниевой солью) для использования препарата в клинической практике в будущем, на сей раз с транспортировкой контрастирующего вещества для выявления ТПГМ по результатам магнитно-резонансной томографии (МРТ). Более того: так как пустые наночастицы индуцировали терапевтический эффект после ТПГМ, можно разработать более эффективные средства нанотерапии путем инкапсуляции лекарственных препаратов внутри наночастиц.

Биомиметические наночастицы – это перспективный инструмент, способный ускорить трансляцию терапии эффективнее, чем клеточные или экзосомальные техники, благодаря простоте его создания и пурификации и сходству между разными группами наночастиц. Обе наночастицы, описанные в представленной работе, являются биомиметическими и имитируют либо только липидный состав клетки мыши, либо состав лейкоцитарных белков вместе с липидным составом клетки мыши. Мембранный белок, презентируемый на наночастицах Leuko, обеспечил более точное таргетирование поврежденных тканей головного мозга и дольше находился в системе кровообращения (т.е., Leuko все еще циркулировали в организме спустя 24 часа после травмы).

В рамках представленного исследования мы также обнаружили релевантные различия в биодистрибуции наночастиц в фильтрующих органах после травмы головного мозга. На основе этих данных можно в будущем разработать стратегию местного и системного таргетирования.

Наши результаты демонстрируют, что биомиметические наночастицы являются потенциальными кандидатами в средства фармакотерапии при ТПГМ в острой стадии. Наблюдая за внедрением наночастиц в воспаленные ткани, мы можем разработать способы преодоления затруднений в лечении ТПГМ благодаря фармакотерапии, воздействующей на специфические механизмы воспаления.

Другие актуальные исследования:

Дата публикации: 02.11.2021