Израильское исследование показало, как справиться с опасной бактерией

Новое исследование, проведённое учёными Еврейского университета в Израиле и Национального университета Сингапура, впервые показало, как можно справиться с особо опасными бактериями – стрептококками группы А. Они вызывают у людей множество опасных заболеваний – от поверхностных инфекций горла и кожи до опасных для жизни заболеваний, таких, как некротический фасциит, случаи которого в последние годы участились. Смертность от этой патологии достигает 45%, даже при правильном и раннем лечении. Во всём мире около 18 млн человек страдают от различных заболеваний, вызванных стрептококками группы А. При этом до сих пор не существует эффективной вакцины против таких болезней. Поэтому есть острая необходимость в разработке новых методов лечения. Один из таких методов разработали авторы исследования.

Авторы исследования: Дебабрата Бисвас, Пурнима Амбалаванан (Национальный университет Сингарупа), Мириам Рейвинс, Гилад Бахрач (Еврейский университет), Вероник Ангели (Национальный университет Сингапура), Эммануэль Хански (Еврейский университет).

Вступление

Стрептококки группы A (СГА) вызывают у человека различные инфекционные заболевания, включая доброкачественные, поверхностные самоограничивающиеся и высокоинвазивные, смертельно опасные патологии – например, некротизирующий фасциит (НФ), синдром стрептококкового токсического шока и бактериемию. Для инвазивных инфекций характерны высокие показатели смертности, даже несмотря на своевременное применение антибиотиков и хирургическую обработку^{[1, 2, 3, 4]}. Кроме того, СГА вызывают осложнения со стороны иммунной системы в форме острой ревматической лихорадки, ревматических болезней сердца и гломерулонефрита^[5]. Согласно недавним подсчетам, СГА входят в перечень из десяти ведущих причин смерти от инфекционных заболеваний^[6]. Эффективной вакцины против СГА не существует, и потому очень важно в срочном порядке разработать новые способы борьбы со СГА-инфекциями^[7].

Человеческий антимикробный пептид (АМП) кателицидин состоит из единственного генного продукта – hCAP-18. При расщеплении hCAP-18 генерирует несколько фрагментов с противомикробной активностью, из которых доминантной формой выступает LL-37^[8]. CRAMP (кателин-подобный АМП) является мышиным ортологом LL-37^{[9, 10, 11]}. Так как при отсутствии CRAMP у мышей повышается уязвимость перед СГА-инфекциями мягких тканей, многие эксперты считают, что CRAMP и соответственно LL-37 действуют против СГА-инфекции, уничтожая бактерии в рамках своей бактерицидной активности^[12]. И действительно: и CRAMP, и LL-37 отличаются схожей бактерицидной активностью (минимальная ингибирующая концентрация [МИК]) против СГА in vitro^[13]. Вместе с тем в суббактерицидных концентрациях LL-37 играет важную роль на многих уровнях иммунной реакции.

Большинство эффектов, вызванных LL-37, опосредуются через активацию нескольких рецепторов, не имеющих структурной связи друг с другом^[14]. К таким рецепторам относятся:

• Рецепторы пептида N-формила (FPR1/2);
• Рецептор комплемента CD11b/CD18 (Mac-1);
• Пуринергический рецептор P2X7 (P2X7R);
• Рецептор эпидермального фактора роста (EGFR).^{[15, 16, 17, 18, 19]}

FPR1/2, Mac-1 и P2X7R играют важнейшую роль в обеспечении таких функций нейтрофилов, как хемотаксис, бактериальный фагоцитоз, апоптоз и воспаление. Аналогичным образом, P2X7R и EGFR контролируют и безусловные иммунные реакции, и процессы заживления ран через различные эффекторные клетки: дендритные клетки, T-клетки, тучные клетки, моноциты, макрофаги и др. Более того: P2X7R может давать различные и даже контрастирующие эффекты при инфекционных заболеваниях, защищать или усугублять в зависимости от клеточного типа, патогена и степени тяжести болезни.

Ранее мы разработали мышиную модель человеческого некротизирующего фасциита и продемонстрировали, что СГА формируют в зоне фасции структуры, напоминающие биопленку и не позволяющие нейтрофилам проникнуть в инфицированную область. ScpC, или SpyCEP, – это один из основных факторов вирулентности СГА, предотвращающий проникновение нейтрофилов в фасции, оккупированные стрептококками. ScpC – это поверхностная субтилизин-подобная протеаза, которая расщепляет и деактивирует интерлейкин-8 (ИЛ-8, CXCL8) и существует во всех клинических изолятах СГА. В результате расщепления ИЛ-8 нарушаются такие функции нейтрофилов, как миграция, уничтожение бактерий и образование нейтрофильных внеклеточных ловушек (NET). ScpC также расщепляет мышиные хемокины MIP-2 и KC, отвечающие за рекрутмент нейтрофилов. Изогенный мутант СГА, лишенный ScpC, авирулентен в мышиных моделях человеческого некротизирующего фасциита. Вместе с тем он вирулентен и смертелен при отсутствии в мышиной модели нейтрофилов. Эти факты подчеркивают критическую роль ScpC в нарушении функций нейтрофилов.

Дальнейшие наблюдения позволили предположить, что роль LL-37 состоит не только в прямом уничтожении СГА. Наблюдались следующие явления:

• Колокализация жизнеспособных бактерий и LL-37 в тканях пациентов с некротизирующим фасциитом, вызванным СГА-инфекцией;
• Апрегуляция экспрессии факторов вирулентности, включая собственно ScpC, вследствие выявления LL-37 через основной регулятор СГА – CovRS, или CsrRS.

Несмотря на то, что недавние исследования пролили свет на различные функции факторов вирулентности СГА, до сих пор неизвестно, как именно работают защитные механизмы хозяина.

В данной работе мы демонстрируем, что ScpC воздействует непосредственно на LL-37, расщепляя его на два фрагмента. В суббактерицидной концентрации эти фрагменты ликвидируют способность LL-37 активировать несколько рецепторов хозяина, включая P2X7R и EGFR, и тем самым препятствуют уничтожению бактерий, заживлению поражений мягких тканей и устранению СГА-инфекции. Тем не менее, даже при расщеплении сохраняется как бактерицидная активность пептида, так и его способность стимулировать двухкомпонентную систему СГА – CovRS (или CsrRS).

Ход Исследования

В данной работе мы демонстрируем, что LL-37 служит естественным субстратом для ScpC. Расщепление LL-37 под воздействием ScpC нейтрализует активацию P2X7R и EGFR, происходящую при суббактерицидных концентрациях LL-37 и необходимую для защиты против СГА-инфекций мягких тканей. И действительно: нерасщепляемые пептиды LL-37K8R и LL-37S9T защищают мышей от инвазивных СГА-инфекций мягких тканей, в то время как антагонисты P2X7R и EGFR аннулируют этот защитный эффект.

Результаты дальнейшего наблюдения поддерживают предположение о том, что именно LL-37-опосредованная активация рецепторов на поверхности клеток хозяина, а не бактерицидная активность пептида, служит определяющим фактором в обеспечении защиты хозяина от СГА-инфекций мягких тканей. По итогам анализа образцов тканей, полученных методом биопсии у пациентов с некротизирующим фасциитом, обнаружилась колокализация живых бактерий с LL-37 и положительная корреляция между бактериальной нагрузкой и уровнем LL-37 в тканях. Это значит, что концентрации LL-37 в тканях недостаточно для того, чтобы уничтожить бактерии.

МИК LL-37 против СГА варьируется в пределах 20-50 мкм. Вместе с тем при концентрации в 13-25 мкм LL-37 становится цитотоксическим для нескольких эукариотических клеток. Соответственно, LL-37 не достигнет такой высокой концентрации даже в условиях инвазивной инфекции. СГА отвечают на суббактерицидные концентрации LL-37 путем апрегуляции своего регулятора факторов вирулентности CovRS (капсульного регулятора синтеза, или CsrRS). Чувствительность СГА к суббактерицидным концентрациям LL-37 позволяет бактериям быстро повышать свою резистентность и лучше справляться с защитными механизмами хозяина.

ScpC служит важнейшим фактором вирулентности в инфекции мягких тканей. Он имеется у всех вирулентных штаммов стрептококков группы A. В мышиной модели человеческого НФ нейтрофилы не проникают через микроколонии в фасции, похожие на плотную биопленку, и потому не уничтожают СГА. В дальнейшем бактерии распространяются в нижние слои тканей. Вместе с тем в мышиных моделях с изогенным мутантом, лишенным scpC, нейтрофилы успешно проникают в фасцию и уничтожают бактерии, тем самым предотвращая распространение СГА. LL-37 (в суббактерицидных концентрациях) вызывает формирование ИЛ-8 в нескольких клетках хозяина и служит непосредственным хемоаттрактантом для нейтрофилов. LL-37 также взаимодействует со множественными рецепторами иммунных клеток и теми рецепторами хозяина, которые участвуют в заживлении ран. Таким образом, ScpC, по всей вероятности, эволюционировал настолько, чтобы деактивировать ИЛ-8 и LL-37 – и тем самым предотвратить уничтожение СГА нейтрофилами и другими клетками.

Мыши без CRAMP более уязвимы перед СГА-инфекциями. Известно, что нерасщепляемый пептид LL-37S9T в суббактерицидных концентрациях эффективно защищает мышей от СГА-инфекции вне зависимости от наличия в их организме CRAMP. Тем не менее, эффективность уничтожения СГА в отсутствие CRAMP оказалась приблизительно в пять раз ниже по сравнению с эффективностью борьбы с инфекцией в мышиных моделях с CRAMP. Соответственно, бактерицидная активность CRAMP в некоторой степени способствует уничтожению СГА. И действительно, Низе и соавторы (2001) продемонстрировали, что штамм СГА NZ131 (серотип M49) при дефиците CRAMP размножается в цельной крови приблизительно в пять раз интенсивнее по сравнению с размножением бактерий при наличии CRAMP. Выживаемость бактерий в цельной крови зависит от их резистентности к фагоцитозу со стороны нейтрофилов. Таким образом, можно предположить, что CRAMP или LL-37 достигает минимальной ингибирующей концентрации (МИК) внутри фагосомы нейтрофила и тем самым способствует нейтрофил-опосредованному уничтожению СГА.

Результаты

В представленной работе мы демонстрируем, что внеклеточная протеаза СГА ScpC N-терминально расщепляет LL-37 на два фрагмента по 8 и 29 аминокислот, сохраняя его бактерицидную активность. В суббактерицидных концентрациях расщепление ингибирует LL-37-опосредованный хемотаксис нейтрофилов, укорачивает продолжительность жизни нейтрофилов и нейтрализует активацию рецепторов P2X7 и EGF. Мутации в участке расщепления LL-37 защищают пептид от ScpC-опосредованного разделения, сохраняя все его функции. Ортолог LL-37 в мышиных моделях – CRAMP – не расщепляется под воздействием ScpC и не активирует рецепторы P2X7 или EGF. Лечение мышей с отсутствующим CRAMP или CRAMP дикого типа нерасщепляемыми аналогами LL-37 в суббактерицидных концентрациях способствует устранению СГА. Данный эффект обнуляется при введении антагонистов рецепторов P2X7 или EGF. Мы демонстрируем, что LL-37-опосредованная активация рецепторов на поверхности клеток хозяина играет важнейшую роль в защите против СГА-инфекций мягких тканей.

Возможное объяснение явного несоответствия наших выводов выводам Низе и соавторов (2001) заключается в том, что авторы указанного исследования изучали мышиные модели с CRAMP и без CRAMP после введения стрептококков группы A в микроносителях Цитодекс. Такой метод инфицирования мышей приводит к развитию абсцесса, и в область гнойного воспаления поступает сразу множество нейтрофилов. Мы предполагаем, что в условиях сильного воспаления, вызванного микроносителями, стрептококкам не удается предотвратить проникновение нейтрофилов в инфицированную область даже несмотря на экспрессию ScpC. При наличии CRAMP нейтрофилы вступают во взаимодействие с бактериями и уничтожают их более эффективно, чем при отсутствии CRAMP. И действительно: используя ту же самую модель микроносителей Цитодекс, Доршнер и соавторы (2001) обнаружили, что объем CRAMP в ране достигал примерно 0,1 мкг на 1 мг общего белка. Если приблизительный объем общего белка в ране составляет 100 мг/мл, концентрация CRAMP будет достигать 3,0-10,0 мкм. Согласно предположению этой группы экспертов, приблизительная минимальная ингибирующая концентрация CRAMP против СГА составляет от 2,0 до 8,0 мкм. Данный диапазон не соответствует показателям, вычисленным нами (20 мкм) или иными исследователями (12,5 мкм). Вместе с тем вычисление МИК может зависеть от условий и используемых штаммов СГА.

Несмотря на то, что CRAMP во многом схож с LL-37, он не служит субстратом для ScpC, что демонстрирует специфичность бактериального фермента по отношению к молекулам хозяина. В качестве еще одного примера строгой специфичности по отношению к человеческому субстрату можно привести стрептокиназу СГА, которая расщепляет человеческий, но не мышиный плазминоген. Ограниченная специфичность этих ферментов СГА (в обоих случаях регуляция транскрипции обеспечивается CovRS) в отношении человеческих, но не мышиных субстратов, по всей видимости, выработалась за время длительной коэволюции СГА и человека. Парадоксально, но возможность имитировать патогенез СГА в мышиной модели человеческой инфекции мягких тканей может быть отчасти обоснована тем фактом, что CRAMP (в отличие от LL-37) не активирует мышиные P2X7R и EGFR. Соответственно, иммунный ответ, вызванный патогенными микроорганизмами, недостаточен для устранения бактериальной инфекции из мягких тканей мышиной модели. Наш вывод о том, что CRAMP не активирует мышиный P2X7R, соответствует результатам предыдущего исследования, демонстрирующего, что CRAMP способен даже ингибировать активацию P2X7R в мышиных макрофагах.

Сильная сторона нашего исследования состоит в предоставлении убедительных доказательств того, что LL-37-опосредованная активация рецепторов на поверхности клеток хозяина (вместо прямого уничтожения) играет важную роль в обеспечении защиты против СГА-инфекций мягких тканей. Одно из ограничений нашего исследования заключается в том, что нам не удалось продемонстрировать расщепление LL-37 в мышиной модели in vivo. Данное ограничение предположительно связано с введением очень низких (суббактерицидных) концентраций LL-37, которые сложно обнаружить при изучении мягких тканей мышиной модели. Более того: расщепление LL-37 может происходить локально, только в непосредственной близости от микроколоний СГА в фасции. Для подтверждения нашей модели потребуется изучить инфицированные мягкие ткани, полученные от пациентов с некротизирующим фасциитом, и разработать мышиную «нокин»-модель, экспрессирующую LL-37 или нерасщепляемые аналоги на фоне нокаутированного CRAMP. Эти дополнительные эксперименты также могут пролить свет на особенности функционирования P2X7R и EGFR и на роль иных клеток (помимо нейтрофилов) в обеспечении защиты хозяина против СГА-инфекций.

В заключение необходимо отметить, что в данной работе более подробно рассмотрено взаимодействие между стрептококками группы A и организмом человека. Полученные данные можно использовать в разработке эффективных терапевтических средств направленного действия. Такие средства могут помочь в борьбе с различными проявлениями СГА-инфекций, особенно учитывая то, что большинство таких инфекций тяжело поддается лечению по стандартному протоколу, включающему терапию антибиотиками и поддерживающую хирургию. Результаты нашего исследования также подчеркивают важность сигналов LL-37 для безусловной иммунной реакции человека. Данный фактор может лечь в основу терапии, направленной на организм хозяина.

Примечания

1. Molecular insight into invasive group A streptococcal disease
   https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21921933/

2. Molecular mechanisms underlying group A streptococcal pathogenesis
   https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18710460/

3. Disease manifestations and pathogenic mechanisms of Group A Streptococcus
   https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24696436/

4. Evolutionary Constraints Shaping Streptococcus pyogenes-Host Interactions
   https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28216292/

5. Acute rheumatic fever and rheumatic heart disease
   https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27188830/

6. Global, Regional, and National Burden of Rheumatic Heart Disease, 1990-2015
   https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28834488/

7. Clinical development strategy for a candidate group A streptococcal vaccine
   https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28318768/

8. The role of cathelicidins in the innate host defenses of mammals
   https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/16053249/

9. Identification of CRAMP, a cathelin-related antimicrobial peptide expressed in the embryonic and adult mouse
   https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/9148921/

10. The human gene FALL39 and processing of the cathelin precursor to the antibacterial peptide LL-37 in granulocytes
    https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/8681941/

11. Increased serine protease activity and cathelicidin promotes skin inflammation in rosacea
    https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17676051/

12. Innate antimicrobial peptide protects the skin from invasive bacterial infection
    https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/11719807/

13. Cutaneous injury induces the release of cathelicidin anti-microbial peptides active against group A Streptococcus
    https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/11442754/

14. Molecular mechanisms of LL-37-induced receptor activation: An overview
    https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27609777/

15. An angiogenic role for the human peptide antibiotic LL-37/hCAP-18
    https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/12782669/

16. The Human Cathelicidin Antimicrobial Peptide LL-37 and Mimics are Potential Anticancer Drugs
    https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26175965/

17. Mouse cathelin-related antimicrobial peptide chemoattracts leukocytes using formyl peptide receptor-like 1/mouse formyl peptide receptor-like 2 as the receptor and acts as an immune adjuvant
    https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/15879124/

18. Identification of Human Cathelicidin Peptide LL-37 as a Ligand for Macrophage Integrin α M β 2 (Mac-1, CD11b/CD18) that Promotes Phagocytosis by Opsonizing Bacteria
    https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27990411/

19. The antimicrobial peptide LL-37 activates innate immunity at the airway epithelial surface by transactivation of the epidermal growth factor receptor
    https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/14662872/

Другие актуальные исследования:

• Астма не усугубляет течение COVID-19 — результаты нового исследования
• Израильские исследователи обнаружили генетический маркер устойчивой к лекарствам множественной миеломы — путь к разработке индивидуальных методов лечения
• Симптомы коронавируса сохраняются даже через полгода после выздоровления — израильское исследование
• 4 сезона гормональной активности: израильские учёные выяснили, как время года влияет на уровни гормонов