Изучение лонгитюдного ландшафта микросреды глиомы позволило обнаружить перепрограммированные проонкогенные нейтрофилы в костном мозге

Ученые из университета Тель-Авива сделали новое открытие, согласно которому клетки иммунной системы человека, первоначальная роль которых заключается в том, чтобы атаковать и убивать раковые клетки (так называемые нейтрофилы), со временем меняют линию поведения и наоборот усиливают агрессивность опухоли. Это еще один шаг к разработке новых препаратов иммунотерапии рака.

Авторы исследования: Прерна Магод, Игнасио Мастандреа, Лиат Руссо-Нури, Гай Шапира, Ноам Шомрон. Динора Фридманн-Морвински (тель-Авивский университет).

Введение

Высокозлокачественные глиомы ассоциируются с непропорционально высокой заболеваемостью и смертностью. Эти раковые опухоли отличаются упорным злокачественным поведением, для которого характерна обширная инвазия в ткани головного мозга, резистентность к традиционным и инновационным подходам в таргетной терапии, разрушение здоровых тканей головного мозга и неминуемая смерть. Средний возраст пациентов при постановке диагноза составляет 64 года.

Несмотря на интенсивное лечение и совершенствующиеся стандарты терапии, средняя выживаемость пациентов с глиобластомой составляет всего лишь 12-15 месяцев. В ряде случаев отмечается невосприимчивость к терапии (по меньшей мере, частичная) в связи с тем, что препараты воздействуют только на раковые клетки и игнорируют комплексную микросреду вокруг опухолей. Меж тем эта микросреда претерпевает значительные изменения по мере прогрессирования болезни.

«Атлас ракового генома» (TCGA) изначально выделял четыре явно различимых молекулярных подтипа глиобластомы:

1. Нейральную;
2. Пронейральную (PN);
3. Классическую (CL);
4. Мезенхимальную (MES).

В последние несколько лет, в результате более интенсивных анализов генной экспрессии выделяется только три подтипа: PN, MES и CL, причем из разных научных работ видно, что подтипы PN и MES обладают более воспроизводимыми сигнатурами. Недавние отчеты по глиобластоме ясно указывают на то, что межопухолевая гетерогенность, изначально ассоциировавшаяся со свойственной опухоли транскрипционной гетерогенностью, сопровождается изменениями в иммунной микросреде. В некоторых из этих работ изменения в иммунной микросреде анализировались методом одноклеточного транскриптомного анализа (секвенирование РНК одиночных клеток [scRNA-seq]) на основе материала, взятого из резецированных опухолей до и после терапевтического вмешательства, а также методом проточной цитометрии и иммуногистохимии при солидных опухолях. Кроме того, недавно поступило сообщение о втором слое гетерогенности, ассоциированном с развивающимися внутриопухолевыми клетками глиомы и предположительно находящимся под влиянием опухолевой микросреды.

Используя лентивирусную Cre-индуцируемую мышиную модель глиобластомы (GBM), ранее мы продемонстрировали, что глиомы могут развиваться из дифференцированных клеток центральной нервной системы (ЦНС), включая кортикальные нейроны. Используя эту модель, мы продемонстрировали, что трансдукция нейральных стволовых клеток (НСК), астроцитов и даже зрелых нейронов способна привести к образованию злокачественных глиом, и предложили считать пластичность клеток глиомы альтернативным источником внутриопухолевой гетерогенности. В представленной работе мы предприняли попытку изучить лонгитюдные изменения микросреды при опухолях, развившихся из разных онкогенных драйверов, HRas-shp53 (R53) и PDGFB-shp53 (PD53), ассоциированных с человеческими молекулярными подтипами глиобластомы MES и PN, соответственно.

Анализ лентивирусно индуцированных глиобластом методом проточной цитометрии в три разных момента времени – инициация, прогрессирование и конечная точка – выявил существенные флуктуации преимущественно в миелоидном компартменте. Мы обнаружили, что опухоль-ассоциированные макрофаги (ОАМ), определяемые смесью активированной микроглии головного мозга и инфильтрирующих макрофагов из костного мозга, действительно составляют большую часть популяции инфильтрирующих иммунных клеток, что соответствует ранее представленным данным. В данном исследовании мы сообщаем, что нейтрофилы образуют динамическую миелоидную субпопуляцию, и раскрываем ее различные функции и воздействие на глиобластому.

Нейтрофилы традиционно считались первыми клетками-респондерами при патогенных инфекциях. В настоящее время известно, что в дополнение к их первичной функции защиты хозяина нейтрофилы играют важнейшие роли в обеспечении врожденного и приобретенного иммунитета и регулировании гемопоэза, ангиогенеза и заживления ран. В контексте онкологии стало ясно, что нейтрофилы инфильтрируют микросреду опухолей нескольких разных видов, и в последние годы все больше внимания уделяется изучению влияния инфильтрации нейтрофилов на прогрессирование опухоли.

В номенклатуре нейтрофилы и моноциты с иммуносупрессивным действием называются миелоидными супрессорными клетками (MDSCs). MDSCs можно разделить на две субпопуляции: гранулоцитарные (g) или полиморфноядерные (PMN) MDSCs и моноцитарные (m) MDSCs. У мышей нейтрофилы и полиморфноядерные MDSCs морфологически и фенотипически схожи и различаются только функционально, по способности подавлять другие иммунные клетки.

В данной работе мы демонстрируем, что нейтрофилы преимущественно инфильтрируют R53-индуцированные опухоли, во многом схожие с человеческой мезенхимальной глиобластомой. Более того: инфильтрация нейтрофилов начинается на ранних фазах развития опухоли и сохраняется при ее прогрессировании. Деплеция нейтрофилов в начале развития опухоли in vivo позволила обнаружить, что ранняя инфильтрация нейтрофилов сдерживает рост опухоли; эта способность теряется по мере прогрессирования болезни. Вместо того, чтобы изучать опухоль-ассоциированные нейтрофилы (TANs)/полиморфноядерные MDSC совместно с большинством экспертов, мы демонстрируем в данной работе, что нейтрофилы, полученные из костного мозга мышей с R53-опухолями, изначально предрасположены к про-онкогенному функциональному фенотипу.

Наши результаты указывают на то, что функциональная регуляция нейтрофилов происходит ранее, чем считалось, протекает в костном мозге, поддается влиянию онкогенных драйверов и открывает сигнальный путь между опухолью и костным мозгом. Этот сигнальный путь, в свою очередь, влияет на нейтрофилы. Таким образом, знание о том, как опухоль программирует нейтрофилы костного мозга на принятие онкогенного фенотипа, можно использовать в качестве дополнительного и потенциального терапевтического подхода к ингибированию глиобластомы.

Ход исследования

Генерация и характеристика мышиных моделей глиобластомы, индуцированной различными онкогенными драйверами

Ранее мы использовали Cre-индуцируемые лентивирусные векторы для генерации мышиных моделей глиомы, с высокой точностью повторяющих гистопатологические характеристики этого заболевания у человека. В дальнейшем мы расширили область применения данной лентивирусной системы и включили в один вирусный конструкт две мишени (например, экспрессию HRasV12 и деактивацию p53). Таким образом, мы продемонстрировали, что глиомы способны образоваться из дифференцированных клеток (например, нейронов) или недифференцированных нейральных стволовых клеток/клеток-предшественников.

Мы ввели тот же онкогенный лентивирусный вектор (R53) в кору головного мозга (CTX) мышей SynapsinI-Cre (SynI-Cre) с тем, чтобы индуцировать развитие глиобластомы, и назвали эту модель R53. Ранее мы уже сообщали о том, что опухоли у мышей SynI-Cre, получивших инъекцию R53 в кору головного мозга, обладают очень явной сигнатурой молекулярного подтипа MES, для которого характерно повышение Acta2, Chl3l1 и фибронектина. Благодаря нашей гибкой лентивирусной системе мы, использовав другой онкогенный драйвер, сгенерировали вторую модель, представляющую подтип глиобластомы человека PN. Мы ввели мышам группы глиального фибриллярного кислого белка (GFAP)-Cre лентивирус, экспрессирующий PDGFB и shp53 (именуемый PD53), в субвентрикулярную зону (СВЗ).

Секвенирование РНК PD53-индуцированных опухолей подтвердило экспрессию молекулярной сигнатуры PN, а результаты количественной ПЦР подтвердили экспрессию PN-маркеров DLL3, Olig2 и NCAM2. Анализ методом конфокальной микроскопии позволил выявить экспрессию Olig2 и дефицит мезенхимального маркера фибронектина. Важно, что средняя общая выживаемость мышиных моделей следует тенденциям подтипов PN и MES у человека, причем прогноз при PD53-инициированных опухолях относительно благоприятен по сравнению с прогнозом при R53-опухолях.

Драйверные мутации дифференциально формируют иммунную клеточную микросреду

Ранее исследователи уже подтверждали наличие связи сигнатур генной экспрессии с воспалением и измененным иммунологическим ландшафтом. Эта вариация в составе иммунных клеток является следствием экспрессии различных цитокинов и хемокинов, способных стимулировать инфильтрацию отдельных субпопуляций иммунных клеток. Чтобы проверить, действительно ли драйверные генетические мутации, ассоциированные с молекулярными подтипами глиобластомы человека, дифференциально формируют иммунную микросреду, мы произвели анализ опухолей, взятых из вышеописанных сгенерированных моделей, методом проточной цитометрии (флуоресцентно-активированная сортировка клеток [FACS]).

Мы ввели мышам онкогенный (экспериментальный) или имитационный (контрольная группа) лентивирус и по достижении контрольной точки извлекли опухоли. Вначале мы разделили опухоли на отдельные клетки в виде суспензии и сравнили общие иммунные популяции CD45+. В опухолях PD53 обнаружилось гораздо больше иммунных клеток CD45+ по сравнению с опухолями R53. Затем, чтобы идентифицировать репертуар иммунных клеток в опухолевой микросреде, мы увеличили популяцию CD45+ во всех опухолях и проанализировали различные иммунные подклассы. Вначале мы исследовали миелоидный компартмент и общую экспрессию маркеров CD45 и CD11b.

Ранее эти два маркера использовались для различения резидентной микроглии (CD11b+CD45low) и периферических макрофагов моноцитарного происхождения (CD11b+CD45high). Тем не менее, в последние годы эта стратегия подверглась критике, и открылись новые дискуссии по поводу состава компартмента миелоидных клеток в глиомах. В моделях глиомы у грызунов обнаружились обе популяции миелоидных клеток, причем в популяцию CD11b+CD45high входили как макрофаги, так и микроглия.

Примечательно, что по результатам анализа этих двух популяций обнаружилось, что R53-инициированные опухоли имеют гораздо больше клеток CD11b+CD45high по сравнению с PD53-инициированными опухолями. Дальнейший анализ миелоидной популяции CD11b+CD45high подтвердил, что эти отличия также распространяются на макрофаги, моноцитарные миелоидные супрессорные клетки и нейтрофилы. Результаты FACS для некоторых из этих популяций получили подтверждение по итогам конфокальной микроскопии, выявившей инфильтрацию микроглии, макрофагов и нейтрофилов в область опухоли в сравнении с прилегающей тканью головного мозга.

Процентное отношение CD3+ T-клеток слегка варьировалось между разными моделями онкогенных драйверов. Анализ T-клеток выявил, что в R53-опухолях преобладали CD4+ T-клетки, в то время как PD53-опухоли изобиловали клетками CD8+.

В целом, по результатам нашего анализа обнаружилось, что несмотря на меньшее общее количество клеток CD45+ в R53-инициированных опухолях, они обеспечивают более активный рекрутмент периферических иммунных клеток (CD11b+CD45high). Полученные результаты подтверждают предыдущие и недавние выводы о связи человеческого молекулярного подтипа MES с воспалительными инфильтратами.

Химиотерапия снижает количество иммунных клеток, инфильтрирующих опухоли PD53

Считается, что субпопуляция опухолевых клеток, обладающая свойствами стволовых клеток и обычно определяемая термином «стволовые клетки глиомы» (СКГ), отвечает за образование, поддержание и инвазивность глиомы. Важнее всего то, что обширные исследования связывают СКГ с рецидивом опухоли. СКГ можно разделить на две основные группы (MES или PN) в зависимости от их молекулярных сигнатур. В экспериментальных моделях глиобластомы эту разницу иллюстрирует их чувствительность к терапии: сигнатура MES скорее резистентна к терапии, в то время как подтип PN скорее чувствителен к терапии.

Чтобы проверить, влияет ли ответ на терапию, ассоциированный с молекулярными подтипами глиобластомы, на иммунные клеточные инфильтраты, мы изолировали опухолевые СКГ из лентивирусно индуцированных мышиных моделей R53 и PD53 (здесь и далее эти клетки называются R53-СКГ и PD53-СКГ, соответственно). После подтверждения их молекулярного подтипа мы трансплантировали СКГ в головной мозг иммунокомпетентных сингенных мышей для того, чтобы выявить различия в инфильтрации иммунных клеток после лечения химиотерапевтическим препаратом темозоломидом, принимаемым перорально в течение 10 дней.

В первом эксперименте мы продемонстрировали, что, хотя модель R53-СКГ резистентна к темозоломиду, модель PD53-СКГ более чувствительна к препарату. Во втором эксперименте, когда мыши, не получавшие лечения, достигли контрольной точки, мы умертвили всех мышей и проанализировали инфильтрацию иммунных клеток методом проточной цитометрии. Несмотря на отсутствие изменений в более резистентной модели R53-СКГ, в опухолях PD53-СКГ после лечения темозоломидом наблюдалась существенная деплеция инфильтрации иммунных клеток. Из этого следует, что чувствительность PD53-индуцированных опухолей, имитирующих человеческую пронейральную глиобластому, к препарату влияет на инфильтрацию иммунными клетками опухолевой микросреды как функции опухолевого происхождения.

В ранних фазах прогрессирования глиобластомы наблюдаются различия в профилях иммунных клеток

Клеточное звено опухолевой микросреды – это гетерогенная подгруппа нетрансформированных клеток, обеспечивающая поступление питательных веществ и различных факторов и влияющая на развитие и прогрессирование опухоли. Изменения в общем количестве и распределении субпопуляций миелоидных клеток в разные моменты развития опухоли можно использовать в целях изучения влияния иммунных клеток опухолевой микросреды на динамику роста глиобластомы. В этих целях мы воспользовались нашими лентивирусно индуцированными мышиными моделями глиобластомы и отследили клеточные изменения, происходящие начиная с инициации и на протяжении прогрессирования опухоли. Опираясь на среднюю латентность таких опухолей, мы произвели FACS-анализ 2, 5 и 8 недель после лентивирусной индукции заболевания.

В ходе эксперимента наблюдался стабильный рост популяции инфильтрирующих миелоидных клеток (CD11b+CD45high) в R53-индуцированных опухолях в сравнении с PD53-индуцированными опухолями; пик роста пришелся на момент, близкий к конечной контрольной точке (8 недель). Затем мы произвели лонгитюдный анализ субпопуляций в данном компартменте. Несмотря на флуктуации между разными опухолями, одна конкретная популяция – нейтрофилы – сохраняла свою многочисленность начиная с инициации и на протяжении прогрессирования опухолей R53 в сравнении с опухолями PD53.

В дополнение мы произвели аналогичный анализ в двух периферических органах: селезенке и костном мозге. В селезенке общих существенных изменений не наблюдалось, однако в костном мозге флуктуации данных популяций при R53- и PD53-инициированных опухолях стали очевидными в 5 недель. При этом наблюдалась противоположная тенденция в сравнении с профилем головного мозга/опухоли. Мы полагаем, что популяции, содержащиеся в костном мозге в меньшем количестве, предположительно постоянно мобилизуются и рекрутируются к опухолевой микросреде.

Нейтрофилы, инфильтрирующие опухоли на ранних стадиях, ограничивают рост опухоли и улучшают показатели выживаемости

В последнее десятилетие исследователи уделяют все больше внимания роли и значимости нейтрофилов при онкологических заболеваниях. Подчеркиваются как их противоопухолевые характеристики, так и свойства, обеспечивающие поддержку опухоли. Стабильно высокое количество нейтрофилов, рекрутируемых к опухолям R53, побудило нас исследовать их роль в прогрессировании глиомы. Вначале мы стремились выяснить, экспрессируют ли опухолевые клетки (CD45-/GFP+) высокие уровни сигналов рекрутмента нейтрофилов. Ранее исследователи обнаружили связь рекрутмента нейтрофилов с несколькими цитокинами и хемокинами, включая CXCL1, CXCL2, CCL3, интерлейкин-1β (ИЛ-1β), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ) и молекулу межклеточной адгезии 1 типа (ICAM1). И действительно: анализ методом количественной ПЦР выявил, что все эти гены апрегулируются в опухолевых клетках в сравнении с нормальными тканями головного мозга контрольных моделей, получивших инъекцию имитированного лентивируса.

Чтобы изучить роль нейтрофилов in vivo в разные моменты времени в период прогрессирования опухоли, мы произвели деплецию нейтрофилов на стадии инициации опухоли. Мы ввели мышам онкогенный лентивирус (на этот раз экспрессирующий репортер люциферазу [Luc]) и спустя 10 дней произвели деплецию нейтрофилов путем интраперитонеальной инъекции нейтрализующего анти-Ly6G антитела (инъекции производились через день на протяжении двух недель). Контрольным мышам мы ввели контрольное антитело к изотипу иммуноглобулина G2a (IgG2a). У мышей с глиобластомой, получивших инъекцию антитела к Ly6G, в первые 6 дней лечения наблюдалось существенное снижение уровня циркулирующих нейтрофилов в сравнении с мышами, получившими контрольное антитело к изотипу IgG2a.

При низких уровнях нейтрофилов в циркулирующей крови уменьшилось и количество нейтрофилов, инфильтрирующих опухоль. Деплеция нейтрофилов на стадии инициации и всего лишь на короткий срок позволила опухолям развиваться быстрее в сравнении с контрольной группой. В результате снизилась выживаемость без прогрессирования, а общая средняя выживаемость составила 53 дня в сравнении с 86 днями в контрольной группе. Гистопатологический анализ опухолей в конечной контрольной точке не выявил различий в группах мышей, в то время как иммунофлуоресцентное окрашивание позволило обнаружить более высокую экспрессию пролиферативного маркера Ki67 у мышей, получивших антитело к IgG2a.

Далее мы провели похожий эксперимент, но на этот раз произвели деплецию нейтрофилов через 4 недели после инициации опухоли, когда сформировались полноценные глиобластомы. Биолюминесцентная визуализация не выявила существенных различий в развитии опухолей у контрольных мышей и мышей, подвергшихся деплеции нейтрофилов; кроме того, деплеция нейтрофилов после образования опухоли не привела к значительным изменениям в показателях выживаемости. Гистопатологический и иммунофлуоресцентный анализ срезов опухолей в конечной контрольной точке не выявил различий в группах мышей. Полученные результаты указывают на то, что нейтрофилы-«первопроходцы», рекрутированные в период инициации опухоли, обладают антионкогенными свойствами; тем не менее, это временное окно ограничено, и по мере прогрессирования опухоли нейтрофилы теряют свою способность контролировать рост новообразования.

Чтобы подтвердить наличие у «наивных нейтрофилов» (nNΦs) антионкогенных свойств на ранних стадиях развития опухоли, мы произвели модифицированный анализ Уинна, также известный под названием «нейтрализационный анализ опухоли». Для проведения этого эксперимента мы изолировали nNΦs либо «обученные нейтрофилы» (eNΦs) из костного мозга здоровых мышей либо мышей с опухолями R53, соответственно. Затем мы смешали изолированные нейтрофилы с R53-СКГ и ввели их в головной мозг сингенных мышей, ранее не подвергавшихся процедурам.

nNΦs оказали иной эффект на прогрессирование и выживание опухоли, нежели eNΦs: они значительно ингибировали рост опухоли и продлили общую выживаемость. В срезах опухоли, проанализированных в конечной контрольной временной точке, методом окрашивания обнаружилось меньше Ki67 по сравнению с той контрольной точкой, когда опухолевые клетки получили инъекцию nNΦs. Эти наблюдения in vivo раскрывают мощный антионкогенный эффект нейтрофилов, имеющий наибольшую значимость на ранних этапах развития опухоли.

nNΦs цитотоксичны, в то время как eNΦs обладают иммуносупрессивными свойствами

Несмотря на короткий период полураспада нейтрофилов и их низкое содержание в крови (~3–5 x 105 клеток/мл) и опухолях (5% от общего CD11b+CD45high), их фенотипическая изменчивость, ведущая к противоположным результатам в борьбе с опухолью, побудила нас исследовать функцию нейтрофилов, полученных из костного мозга здоровых мышей и мышей с глиобластомами. Выработка нейтрофилов происходит преимущественно в костном мозге, где они проходят большинство стадий созревания. Такие морфологические характеристики, как сегментация ядер, считаются наиболее точными при идентификации зрелых и незрелых нейтрофилов; палочкоядерные нейтрофилы являются незрелыми, в то время как сегментированные ядра отражают зрелое состояние.

Таким образом, вначале мы проанализировали морфологию нейтрофилов, изолированных из костного мозга здоровых мышей (nNΦs) и мышей с опухолями R53 (eNΦs). Мы обнаружили, что популяция eNΦs, изолированная из костного мозга мышей с опухолями R53, отличается от nNΦs более высоким соотношением незрелых нейтрофилов. Полученные результаты соответствуют результатам предыдущих работ, сообщающих о наличии незрелых нейтрофилов в мышиных моделях солидных раковых опухолях и у пациентов с раком легких, раком молочной железы и раком яичников. В то время как большинство исследований сосредоточены на свойствах опухоль-ассоциированных нейтрофилов и полиморфноядерных миелоидных супрессорных клеток, о характеристиках нейтрофилов, выработанных костным мозгом, в опухолях головного мозга почти ничего не известно.

Соответственно, мы изучили функциональные отличия in vivo между nNΦs, извлеченными из костного мозга, и eNΦs в двух независимых моделях глиомы R53, начиная с выработки реактивных форм кислорода (ROS) – важной составляющей эффекторных механизмов нейтрофилов. Исследование базальной выработки ROS выявило тенденцию к повышению уровней eNΦs в сравнении с nNΦs. Тем не менее, после стимуляции форбол-12-миристат-13-ацетатом (PMA), индуцирующим активность никотинамидадениндинуклеотидфосфат-оксидазы (NADPH-оксидазы), в nNΦs уровни выработки ROS повысились в сравнении с eNΦs. Выработка ROS – это мощное противомикробное оружие, но в контексте рака выброс ROS соотносится со способностью к непосредственному уничтожению опухолевых клеток.

И действительно: повышенные уровни ROS с выбросом в условиях максимальной стимуляции (PMA) привели к существенному повышению цитотоксического эффекта при кокультивировании nNΦs с клетками мезенхимальной глиомы, что подтверждает антионкогенные свойства nNΦs. Нейтрофильные внеклеточные ловушки (NET) выбрасываются после активации нейтрофилов, способствуя росту опухоли. Несмотря на то, что кондиционированная среда (КС) клеток глиомы R53 индуцировала образование NET при добавлении к nNΦs, данный эффект оказался более выраженным при добавлении той же КС к eNΦs. Еще одно выявленное нами различие между nNΦs и eNΦs заключается в их способности мигрировать по направлению к КС от клеток глиомы R53. Более высокая способность eNΦs мигрировать к КС, полученная от клеток глиомы R53, может объяснить увеличение количества рекрутируемых нейтрофилов по мере прогрессирования R53-индуцированной опухоли и быструю мобилизацию нейтрофилов из костного мозга в опухоли R53.

Мы также отметили, что, несмотря на средний полураспад nNΦs костного мозга, не превышающий 24 ч при культивировании in vitro, eNΦs из костного мозга сохраняли жизнеспособные клетки, количество которых превышало количество nNΦs более, чем в 10 раз, на протяжении более длительного периода (18 ч против 36 ч, соответственно). Наконец, мы изучили воздействие nNΦs и eNΦs на пролиферацию T-клеток. В многочисленных работах указывается, что PMN MDSC/TANs подавляют пролиферацию T-клеток. Наши результаты демонстрируют, что eNΦs, полученные из костного мозга, оказывают иммуносупрессивное действие на активированные T-клетки – и что это воздействие соотносится с повышенными уровнями экспрессии аргиназы-1 (Arg1) и индуцибельной синтазы оксида азота (iNOS) в eNΦs, ранее ассоциированными с супрессией T-клеток.

Наши наблюдения демонстрируют, что нейтрофилы, полученные из костного мозга, отвечают на опухолевые факторы, обеспечивающие их переключение с антионкогенного фенотипа с высокой цитотоксичностью и поддержкой пролиферации T-клеток на менее цитотоксический фенотип, подавляющий T-клетки и поддерживающий прогрессирование опухоли.

eNΦs, полученные из костного мозга, индуцируют опухолевый ангиогенез

Опухоль-ассоциированные нейтрофилы/PMN MDSC обладают несколькими про-опухолевыми функциями, включая способность поддерживать ангиогенез. Чтобы изучить роль eNΦs, полученных из костного мозга, в ангиогенезе, мы вернулись к модифицированному анализу Уинна и сравнили плотность кровеносных сосудов в разных опухолях. Анализ опухолевых срезов, окрашенных эндотелиальным маркером фактором фон Виллебранда (ФВ), методом конфокальной микроскопии выявил не только повышенную плотность кровеносных сосудов, но и разную морфологию и более высокую дезорганизацию сосудистой сети в опухолях R53 после инъекции eNΦs костного мозга в сравнении с опухолями, получившими инъекцию nNΦs костного мозга. Мы произвели такой же анализ в рамках эксперимента по деплеции нейтрофилов и обнаружили, что ранняя деплеция антионкогенных нейтрофилов привела к повышению плотности кровеносных сосудов в опухоли. При этом в более поздние моменты времени различий не обнаружилось.

Глиобластома – это одна из наиболее богатых кровеносными сосудами опухолей, и в дополнение к обычным механизмам формирования сосудистой сети мы ранее выявили генерацию опухолевых эндотелиальных клеток (TDEC) из СКГ. В условиях гипоксии и по мере прогрессирования опухоли TDEC превращаются в значительную фракцию общей популяции эндотелиальных клеток в глубоких областях новообразований. В представленной работе мы демонстрируем, что несмотря на формирование тубулярных сетей опухолевыми эндотелиальными клетками при их кокультивировании с eNΦs на Матригеле, в присутствии nNΦs образуется меньше тубулярных сетей. Чтобы подробнее охарактеризовать проангиогенное свойство eNΦs, мы произвели полнотранскриптомный анализ мРНК, изолированной из nNΦs и eNΦs костного мозга.

Секвенирование РНК позволило обнаружить 1755 генов с дифференциальной экспрессией между nNΦs и eNΦs, а анализ генной онтологии (GO) выявил биологические пути, ассоциированные с ангиогенезом. Чтобы подтвердить результаты секвенирования, мы произвели анализ таких классических нейтрофил-ассоциированных ангиогенных маркеров, как трансформирующий фактор роста бета (TGFβ), матричная металлопептидаза 9 (MMP9) и фактор роста эндотелия сосудов альфа (VEGFα), методом количественной ПЦР. Полученные результаты дополнительно подтверждают вывод об ангиогенном потенциале eNΦs костного мозга.

Нейтрофилия коррелирует с низкой общей выживаемостью пациентов со злокачественной глиомой

Чтобы дополнительно доказать релевантность наших результатов в отношении организма человека, мы проанализировали массивы данных по пациентам с глиомами. И действительно: в сравнении со здоровыми тканями головного мозга в глиобластомах отмечалась гораздо более высокая инфильтрация нейтрофилов (анализ произведен методом идентификации клеточного типа через оценку относительных подгрупп РНК-транскриптов [CIBERSORT]). Более того: секвенирование РНК одиночных клеток со сравнением фракций иммунных клеток в разных молекулярных подтипах глиобластомы позволило выявить более высокие уровни инфильтрации нейтрофилов в мезенхимальных опухолях по сравнению с пронейральными опухолями. Транскриптомные анализы мезенхимальных и пронейральных опухолей дополнительно подтверждают полученные результаты и демонстрируют значительно более высокую экспрессию цитокинов и хемокинов, доказанно рекрутирующих нейтрофилов, в мезенхимальных опухолях, что соответствует наблюдениям, сделанным в ходе нашего исследования.

Анализ сигнальных путей с применением метода GSEA (анализ с обогащением по функциональной принадлежности) также выявил обогащение набора генов, связанных с нейтрофилами. GO-анализ занимающих высокие позиции (скорректированное p-значение [p-adjust] < 0,05], дифференциально экспрессируемых генов в GSEA выявил существенно повышенную активность таких биологических процессов, как «воспалительный ответ», «сигналы рецептора фактора роста эндотелия сосудов» и «секреция цитокинов» (скорректированное p < 0,05), в мезенхимальных опухолях. Эти обогащенные биологические процессы в человеческих нейтрофилах подтверждают результаты, которые мы получили в ходе экспериментов in vivo при сравнении мышиных eNΦs с nNΦs. Наконец, связь нейтрофилии с худшими показателями общей выживаемости при злокачественной глиоме подтверждает, что нейтрофилы и их пластичность играют важную роль в глиомагенезе.

Выводы

Иммунотерапия навсегда изменила спектр методов лечения рака, и в связи с ее успешным клиническим применением вновь возрос интерес к роли иммунной среды в инициации и прогрессировании опухоли. Лонгитюдный анализ изменений в опухолевой микросреде очень сложно произвести при человеческой глиобластоме в связи с недостатком доступного материала. Транскриптомный анализ на уровне одиночных клеток и сравнение первичных опухолей с рецидивирующими опухолями выявили вариации в частоте инфильтрации глиобластом различных молекулярных подтипов определенными иммунными популяциями.

Исследования человеческих образцов на базе различных подходов продемонстрировали, что мезенхимальные глиобластомы подвергаются инфильтрации более высоким количеством опухоль-ассоциированных макрофагов. Дополнительные доказательства различий в инфильтрации опухоль-ассоциированными макрофагами и мутационной нагрузке в глиомах представлены в исследовании, посвященном сравнению глиом с человеческой мутантной изоцитратдегидрогеназой-1 (IDH mut) и IDH дикого типа (IDH WT). Мутации в этом метаболическом ферменте обычно обнаруживаются в низкозлокачественных глиомах (II-III стадии злокачественности) и отличаются более благоприятным прогнозом в сравнении с высокозлокачественными глиобластомами (IV степень злокачественности, IDH WT). Все эти исследования оказались очень полезны при изучении иммунологической архитектуры опухолей головного мозга в отношении их геномных профилей. Тем не менее, они не позволяют подробнее изучить причинную связь каждой из инфильтрирующих популяций иммунных клеток с инициированием и прогрессированием опухоли.

За счет использования Cre-индуцируемой лентивирусной мышиной модели глиобластомы нам ранее удалось воспроизвести гистопатологические характеристики и молекулярную сигнатуру этого заболевания у человека. В представленном исследовании мы использовали данную модель глиобластомы для изучения лонгитюдного иммунного ландшафта опухолей, инициированных разными онкогенными драйверами. Наши результаты поддерживают представление о том, что межопухолевая гетерогенность и комплексность распространяются за пределы опухолевых клеток и отражаются в иммунных клетках опухолевой микросреды. Наши анализы в последней контрольной точке выявили, что опухоль-ассоциированные макрофаги представляют большинство CD45+high иммунных клеток в глиобластомах R53 и соответствуют результатам прошлых исследований с применением мышиных моделей и человеческих образцов.

Опухоль-ассоциированные макрофаги – это наиболее изученные и подробно охарактеризованные иммунные клетки, обладающие про-онкогенными функциями в опухолевой микросреде. Доказано, что со временем их количество в опухолях мыши и человека увеличивается. Попытки воспрепятствовать рекрутменту опухоль-ассоциированных макрофагов в преклинических моделях глиобластомы увеличили выживаемость мышей с опухолями. Известно, что помимо опухоль-ассоциированных макрофагов паренхиму глиобластомы также инфильтрируют другие миелоидные и лимфоидные клетки. В представленной работе мы демонстрируем, что нейтрофилы преимущественно инфильтрируют R53-индуцированные опухоли, имитирующие мезенхимальную глиобластому человека, и что ранние опухоль-инфильтрирующие нейтрофилы обладают противоопухолевыми свойствами, которые теряются по мере прогрессирования глиобластомы.

В последние десять лет роль нейтрофилов расширилась с важной эффекторной функции в воспалительной реакции и защите против патогенных микроорганизмов до гораздо более масштабной роли в координировании врожденных и приобретенных иммунных реакций. При онкологических заболеваниях нейтрофилы преимущественно ассоциируются с проопухолевой функцией, а нейтрофилия и повышенное отношение нейтрофилов к лимфоцитам (NLR) ассоциируются с неблагоприятным прогнозом. При глиомах экспериментальные и клинические данные указывают на то, что нейтрофилы способствуют пролиферации клеток глиомы, поддерживают способность СКГ к самообновлению и облегчают ангиогенез и развитие резистентности к терапии. Большая часть имеющихся данных основывается на циркулирующих нейтрофилах и PMN MDSC/TAN на поздних стадиях развития опухоли, причем механизмы, участвующие в обеспечении такого эффекта, все еще изучаются.

В рамках представленного исследования мы сообщаем, что нейтрофилы инфильтрируют опухоли R53 в период их инициации и прогрессирования, и наиболее высокие уровни инфильтрации отмечаются в конечной контрольной точке. Мы подтвердили, что опухоли R53 экспрессируют соответствующие стимулы активного рекрутмента нейтрофилов, включая CXCL1, CXCL2 и Г-КСФ, причем последний благоприятствует гемопоэзу в костном мозге по гранулоцитарному пути развития, а не дифференциации лимфоцитов. Чтобы оценить функциональную роль рано рекрутированных нейтрофилов в сравнении с поздно инфильтрирующими нейтрофилами, мы произвели деплецию нейтрофилов в два разных момента в развитии опухоли.

Опухоли росли быстрее при деплеции нейтрофилов на стадии инициации, что свидетельствует о наличии у ранних опухоль-инфильтрирующих нейтрофилов антионкогенных свойств и подтверждает, что они действительно рекрутируются с целью предотвращения прогрессирования опухоли. Вместе с тем деплеция на поздней стадии, при достаточно развитой опухоли, не оказала существенного влияния на прогрессирование опухоли в нашей модели мезенхимальной глиобластомы. Недавно эксперты продемонстрировали, что деплеция гранулоцитарных миелоидных супрессорных клеток с антителом к Ly6G улучшает показатели выживаемости сингенных моделей глиобластомы GL261; вместе с тем разницу в результатах можно объяснить такими факторами, как временное окно для нейтрализации инъекции антитела, размер опухоли, модель опухоли и пол мышей. Гетерогенность и пластичность нейтрофилов хорошо изучены; известно, что подобные им популяции играют различные роли в развитии рака. Нейтрофилы из крови онкобольных делятся на разные подгруппы в зависимости от их плотности, причем нейтрофилы нормальной плотности (NDN) ассоциируются с цитотоксическим противоопухолевым эффектом, а зрелые и незрелые нейтрофилы низкой плотности (LDN) – с иммуносупрессивными, проопухолевыми свойствами.

Нейтрофилы, выявляемые в области опухолей, можно поляризовать в направлении опухоль-ингибирующего (N1) или опухоль-стимулирующего (N2) фенотипа аналогично динамическим состояниям анти- и проопухолевых макрофагов (M1 и M2). О фенотипе и функциональной роли нейтрофилов костного мозга – особенно в опухолях головного мозга – известно не так много. По результатам нашей работы видно, что нейтрофилы костного мозга, взятые у мышей с глиомами (eNΦs) преимущественно пребывают в незрелом состоянии по сравнению с нейтрофилами костного мозга, изолированными у здоровых мышей (nNΦs). Функциональные свойства и релевантность незрелых нейтрофилов в контексте онкологических заболеваний недостаточно изучены.

В представленной работе мы продемонстрировали, что eNΦs костного мозга являются перепрограммированными и обладают проопухолевым функциональным свойством, поддерживаемым их проангиогенным и иммуносупрессивным воздействием. Несмотря на то, что в анализах in vivo (анализ Уинна) и in vitro у nNΦs костного мозга обнаружились цитотоксические и антионкогенные характеристики, у eNΦs костного мозга обнаружился противоположный эффект, указывающий на то, что переключение фенотипа происходит еще до достижения клетками опухоли и ее микросреды. Эти результаты указывают на системную регуляцию иммунных клеток глиобластомой до их рекрутмента и мобилизации к области опухоли. В то время как взаимодействие между иммунными и раковыми клетками в области опухоли активно исследовалось, системные иммунные изменения в отдаленных микросредах и их воздействие на рост опухоли все еще недостаточно изучены. Доказательства перекрестного взаимодействия между опухолями легких и костями представлены в очень наглядном исследовании, демонстрирующем активацию остеобластов и последующую индукцию проонкогенных нейтрофилов.

При раке молочной железы выработка опухолью Г-КСФ индуцирует активацию миелоидной дифференциации в костном мозге, которая, в свою очередь, приводит к генерации иммуносупрессивных нейтрофилов. Недавно эксперты продемонстрировали системные иммунные изменения в нескольких разных моделях рака, и из всех популяций иммунных клеток именно уровни нейтрофилов стабильно повышались по мере развития рака. Наши результаты соответствуют приведенным наблюдениям и обосновывают системное иммунное ремоделирование нейтрофилов при глиобластоме несмотря на ее нахождение в головном мозге. Эксперты все еще изучают то, как клетки опухоли мозга организуют мобилизацию, рекрутмент и поляризацию нейтрофилов. Результаты изучения других опухолей указывают на то, что молекулы, контролирующие выброс нейтрофилов из костного мозга, апрегулируются в опухолевых клетках и опухоль-ассоциированных клетках в микросреде либо системно.

Наши результаты свидетельствуют о том, что сигналы, поступающие от раковых клеток, включая CXCL1, CXCL2 и Г-КСФ, играют важную роль в мобилизации и выбросе нейтрофилов из костного мозга. Это относится даже к нейтрофилам в незрелом состоянии. На данном этапе можно только предположить, что в дополнение к этим факторам опухолевые клетки регулируют экспрессию (либо обеспечивают блокаду) других молекул, отвечающих за удержание нейтрофилов в костном мозге. Наши данные, полученные ex vivo, указывают на разные функциональные свойства незрелых eNΦs и зрелых nNΦs костного мозга, что свидетельствует о раннем начале поляризации нейтрофилов во время гранулопоэза в костном мозге. Пока неизвестно, предопределена ли судьба этих отчетливо разных популяций. Возможно, по достижении опухоли происходит дальнейшая поляризация. Раскрытие механизмов системной иммунной дисфункции, включая перепрограммирование нейтрофилов, поможет не только прогнозировать прогрессирование опухолей, но и лучше прогнозировать результаты иммунотерапии.