Комбинированный анализ презентации и иммуногенности позволил выявить рекуррентный неоантиген RAS.Q61K у пациентов с меланомой

Израильские ученые обнаружили неоантиген, который аткрывает новые перспективы для иммунотерапии меланомы.

Исследователи из Института Вейцмана в Израиле обнаружили особый неоантиген, который появляется у тысяч пациентов с меланомой каждый год и может служить целью для разработки новых методов лечения больших групп пациентов. Результаты исследования были опубликованы в журнале Journal of Clinical Investigation.

Авторы исследования: Авия Пери, Эрез Гринштейн, Михал Алон, Джой А. Паи, Тамир Дингджан, Шломит Рейч-Зелингер, Эйлон Барнеа, Шая Барболин, Ронен Леви, Клаудиа Арнедо-Пак, Шелли Калаора, Барекет Дасса, Эстер Фельдмессер, Пинг Шенг, Полина Гринберг, Ишай Левин, Гиль Бенедек, Митчел П. Левескью, Давид Дж. Адамс, Михаль Лотем, Джеймс С. Уилмотт, Ричард А. Сколиер, Гёран Б. Джонсон, Артье Адмон, Стивен А. Розенберг, Сирил Дж. Коэн, Маша Нив, Нурия Лопес-Бигас, Ансуман Т. Сатпаси, Нир Фридман, Ярдена Семюэлс (Институт Вейцмана, Израиль).

Введение

В последние годы иммунотерапия стала новой надеждой в онкологии благодаря своей необычайной способности индуцировать долгосрочную регрессию опухоли у больных метастатическим раком. Этим свойством обладают различные методы иммунотерапии, включая и блокаду контрольных точек иммунного ответа, и адоптивный перенос (ACT) опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов (TILs). Считается, что окончательный общий механизм действия этих двух методов заключается в специфическом распознавании опухолевых антигенов цитотоксическими T-лимфоцитами. По результатам подробного анализа историй успеха иммунотерапевтических средств удалось выявить центральную роль обусловленных мутацией антигенов, определяемых как неоантигены, в опосредовании противоопухолевого иммунного ответа.

Неоантигены – это поверхностные клеточные HLA-пептидные комплексы, в которых пептидный компонент (т.е., неопептид) является измененным продуктом распада мутировавшего белка. Неоантигены экспрессируются только пораженной тканью и высвобождаются благодаря иммунной толерантности. Соответственно, они способны придать соединениям T-клеточного рецептора (TCR) специфическую противоопухолевую реактивность и стать идеальными средствами терапии.

Подавляющее большинство неоантигенов, выявленных у пациентов, происходят из частных, нерекуррентных мутаций и потому, несмотря на эффективность, не предрасполагают к генерализации и применению вне индивидуального контекста. Частые неоантигены – то есть, неоантигены, возникающие у многих онкобольных, – пользуются огромным спросом по двум основным причинам.

Во-первых, частые неоантигены способны проложить путь к клеточным препаратам массового производства, вакцинам и стратегиям скрининга. Опухолевые клетки, экспрессирующие подтвержденные комбинации HLA и мутаций, должны быть уязвимы перед иммунотерапией. Даже при отсутствии изначального иммунного распознавания предопределенные T-клеточные рецепторы от других пациентов и даже здоровых доноров можно использовать в целях перенаправления аутологичных T-клеток против частых неоантигенов.
Во-вторых, частые неоантигены потенциально превосходят индивидуальные неоантигены в качестве мишеней для терапии. Дело в том, что иммунотерапия, направленная на субклональные мутации гетерогенных опухолей, может облегчить уход от иммунного ответа, в то время как частые неоантигены, преимущественно получаемые из клональных онкогенных мутаций, предположительно характеризуются большей гомогенностью внутри опухолевых тканей.

За последние годы удалось обнаружить несколько потенциально рекуррентных неоантигенов, обусловленных такими известными онкогенами, как BRAF, NRAS и p53. Клиническую релевантность таких неоантигенов, впрочем, непосредственно продемонстрировали лишь недавно, через успешное лечение пациента с метастатическим раком толстой кишки методом адоптивного переноса, с использованием аутологичных TILs, направленных на впервые выявленный рекуррентный неоантиген HLA-C*08:02/KRAS.G12D.

Недавние успехи побудили экспертов возобновить попытки выявления частых неоантигенов. Скрининг на p53 позволил обнаружить нативную реактивность опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов по отношению к извлеченным неоантигенам у 8% пациентов, прошедших скрининг, причем в нескольких случаях обнаружились рекуррентные неоантигены. Другие эксперты сосредоточились на идентификации в периферической крови пациентов или здоровых доноров таких T-клеток, которые воздействовали бы на специфические частые неоантигены, расширяя тем самым репертуар известных неоантигенов из KRAS и других онкогенов для HLA I класса и HLA II класса.

Некоторые из вышеперечисленных рекуррентных неоантигенов были обнаружены по счастливой случайности. Другие ученые сосредоточились на частых мутациях и/или превалирующих HLA-аллелях. Вместе с тем действительно рекуррентные неоантигены образуются только на продуктивном пересечении рецидивирующих онкогенных мутаций и распространенных HLA-аллелей. Рекуррентные онкогенные мутации, представляющие собой ранние события в развитии новообразования, потенциально уязвимы перед эффектом иммуноредактирования.

По результатам недавнего биоинформатического анализа обнаружилось, что у пациентов с раком реже встречаются онкогенные мутации, предсказуемо связывающиеся с их HLA-аллелями. Вместе с тем другие эксперты не нашли доказательств такого искажения. В целях правильного отбора кандидатов пересечения HLA-аллелей и мутаций желательно исследовать в той популяции онкобольных, где отмечается потенциальное искажение. Благодаря возросшей доступности результатов секвенирования данных, полученных от пациентов, проведение таких анализов стало возможным. Более того: алгоритмы связывания HLA, хорошо отработанные на превалирующих HLA-аллелях, могут указать на самые перспективные комбинации HLA-мутаций.

На данный момент попытки выявить неоантигены почти исключительно сосредоточены на T-клетках. В рамках таких методик неопептиды-кандидаты искусственно экспрессируются в антигенпрезентирующих клетках (APCs) либо в виде активированных синтетических пептидов, либо через сверхэкспрессию минигенов. После этого APCs ко-инкубируют с T-клетками, чаще всего TILs, а профиль их ответа интерпретируют для опосредованной идентификации неоантигенов. Дальнейшее описание и валидация настолько сильно зависят от прогнозируемого связывания, что в число идентифицируемых неоантигенов входят только те, которые одновременно и предрасположены к связыванию, и являются иммуногенными в организме изучаемого пациента.

Более того: можно пропустить представленные неоантигены, не индуцирующие реактивности у изучаемого пациента. HLA-пептидомика использует иммуноаффинную пурификацию HLA-пептидных комплексов с последующей жидкостной хроматографией/тандемной масс-спектрометрией (LC/MS-MS) для того, чтобы охарактеризовать репертуар антигенов с активной презентацией. В отличие от вышеописанных методов, она позволяет напрямую идентифицировать неоантигены из опухолевых образцов. Мы успешно использовали HLA-пептидомику в лаборатории с целью выявления неоантигенов в опухолевых клетках.

Наука давно признает каузальную роль RAS-белков в развитии рака. Активные мутации происходят в одной трети человеческих злокачественных опухолей. Соответственно, большой интерес представляют рекуррентные неоантигены из белков RAS. Три основных изоформы – KRAS, NRAS и HRAS – имеют идентичный N-конец из 86 аминокислот. Благодаря этому идентичному участку удалось распознать три мутационных горячих точки на позициях 12, 13 и 61.

Из всех изоформ RAS в злокачественных опухолях чаще всего мутирует KRAS (85% мутаций RAS). Тем не менее, при меланоме наиболее эффективной мишенью для иммунотерапии остаются мутации NRAS. В частности, NRAS.61 занимает второе место среди наиболее часто мутирующих позиций при меланоме и обнаруживается почти у 20% пациентов. NRAS-мутантная меланома ассоциируется с более неблагоприятным исходом лечения в сравнении с меланомой без мутаций в NRAS. Множественные попытки разработать NRAS-таргетную терапию пока не привели к появлению эффективных, одобренных терапевтических средств. В отсутствие успешных NRAS-таргетных препаратов иммунотерапия играет ключевую роль в текущих схемах терапии, направленной на борьбу с NRAS-мутантной меланомой.

В представленной работе мы, исходя из имеющихся данных, использовали спектр различных методов выявления рекуррентных неоантигенов с комбинированным анализом презентации и иммуногенности. Мы сообщаем об открытии часто презентируемого и иммуногенного RAS.61-обусловленного хотспот-неоантигена, присутствующего у существенной группы онкобольных. В дальнейшем мы идентифицировали неоантиген-специфические TCRs в TILs у двух неродственных пациентов и дали транскрипционную характеристику неоантиген-специфическому T-клеточному ответу на уровне одиночных клеток.

Ход исследования

Отбор неоантигенов-кандидатов на основании полученных данных

NRAS.Q61 занимает второе место среди наиболее часто мутирующих позиций при меланоме, однако не все из обусловленных ею неоантигенов имеют одинаково рекуррентный характер. Для того, чтобы она представляла интерес в качестве хотспот-неоантигена, частота ее комбинированных HLA-аллелей/мутаций должна быть высокой у пациентов с раком. Здесь мы применили подход к выявлению неоантигенов, основанный на имеющихся данных и анализе генетической информации пациента для сосредоточения на кандидатах с высоким потенциалом.

Принимая во внимание только те HLA-аллели, которые обнаруживались в анализируемых блоках данных одновременно с мутациями RAS.Q61, мы использовали NetMHCpan для прогнозирования связывания RAS.Q61-обусловленных неопептидов длиной от 8 до 14 аминокислот. Используя эти данные, мы присвоили каждой комбинации HLA-мутаций 2 индекса:

(a) ее частотность в когорте;
(b) наиболее высокий прогнозируемый индекс связывания (т.е., наилучшее процентное отношение [здесь и далее «%Rank»], превосходящее неопептиды с прогнозируемым связыванием).

Затем мы осуществили поэтапную фильтрацию и сортировку, определив порог частотности и упорядочив оставшихся кандидатов в соответствии с их предполагаемым потенциалом связывания.

Так как три изоформы RAS – NRAS, KRAS и HRAS – имеют идентичную последовательность N-конца, мы включили в анализы все эти изоформы вместе с четырьмя наиболее превалирующими заменителями RAS.Q61-аминокислот: аргинином, лизином, лейцином и гистидином.

Пользуясь вышеописанной схемой, мы проанализировали три когорты меланом:

Атлас ракового генома (TCGA) с объединением и мутаций, и HLA-I аннотаций для 363 случаев меланомы;
Базу данных «Hartwig», содержащую информацию о 221 таком пациенте;
Ранее опубликованный набор данных MELA-AU с информацией о 69 пациентах.

RAS.Q61-мутантные опухоли обнаружились у 95 (26%), 60 (27%) и 15 (22%) пациентов из этих когорт, соответственно. Как и ожидалось, мы выявили, что наиболее частыми заменителями аминокислот на позиции 61 становились аргинин (46–60%) и лизин (35–47%); NRAS оказалась наиболее часто мутирующей изоформой RAвы S на позиции 61 (96–100% от всех мутаций RAS.61). Сравнение частот HLA-аллелей между пациентами TCGA с RAS.Q61-мутантными опухолями и меланомами WT RAS.Q61 не выявило существенных отклонений в превалентности.

Сопоставление комбинаций HLA/мутаций по индексам продемонстрировало принципы приоритизации наиболее перспективных кандидатов. Из трех наборов данных HLA-A*01:01 выделился за счет того, что фигурировал у двух лучших кандидатов: HLA-A*01:01/RAS.Q61R и HLA-A*01:01/RAS.Q61K. Таким образом, для дальнейшего анализа мы выбрали HLA-A*01:01.

В соответствии с его частой встречаемостью в общей совокупности населения, HLA-A*01:01 обнаружился у 26-38% пациентов из проанализированных раковых когорт. Важно, что частотность аллеля не снизилась при ограничении когорты пациентами с RAS.Q61-мутантной меланомой: он обнаружился в 27-40% случаев. HLA-A*01:01 вместе с мутациями RAS.Q61 удалось выявить у 7-8,7% пациентов с меланомой. В частности, по результатам нашего анализа у 3,3–4,5% и 3–4,3% пациентов обнаружились комбинации HLA-A*01:01/RAS.Q61R и HLA-A*01:01/RAS.Q61K, соответственно.

Программа NetMHCpan 4.0 спрогнозировала 32 RAS.Q61-обусловленных неопептида для A*01:01, включая 9 спрогнозированных сильных связывателей. Важно, что тот же самый «канонический пептид», ILDTAGXEEY, оказался на вершине рейтинга связывания одновременно и для RAS.Q61R, и для RAS.Q61K (прогнозируемая аффинность связывания 202,4 нм и 218,5 нм, соответственно), в то время как его менее превалентные варианты (RAS.Q61L и RAS.Q61H), по прогнозам, также должны связываться с аллелем A*01:01 (58,2 нм и 101,8 нм, соответственно).

Стоит отметить, что наш пан-раковый анализ отражает принципы нашей приоритизации кандидатов при меланоме. Мутации RAS.Q61 достаточно часты и обнаружились в 3,3–5,9% пан-раковых случаев (226 из 6824 и 123 из 2091 пациента из баз данных TCGA и Hartwig, соответственно). Таким образом, релевантность неоантигена HLA-A*01:01/RAS.Q61 не ограничивается меланомой.

Непосредственная идентификация HLA-A*01:01/RAS.Q61-обусловленных неоантигенов с применением системы моноаллельной экспрессии

В отличие от случая RAS.Q61R, эксперты ранее не выявляли неоантигенов для рекуррентной комбинации HLA-A*01:01/RAS.Q61K. Сосредоточившись на RAS.Q61K, мы решили исследовать HLA-A*01:01-связанный неоантигенный ландшафт без предубеждения. В этих целях мы на основе 721.221 создали моноаллельную клеточную линию HLA-A*01:01 со сверхэкспрессией 25-мер RAS.Q61K-минигена и подвергли ее HLA-пептидомике. Условие сверхэкспрессии дало такие преимущества, как доступность и амплификация неоантигенов с одновременным сохранением обработки и презентации нативных антигенов.

Мы проанализировали результаты масс-спектрометрии (MS) с помощью MaxQuant и сопоставили их с данными человеческого протеома (Uniprot), к которым вручную добавили последовательность минигенов. В сумме мы выявили 2403 пептида для 721.221A*01:01;mRAS.Q61K. Хотя программа NetMHCpan спрогнозировала 7 разных HLA-A*01:01-связывающих неопептидов для RAS.Q61K, мы идентифицировали единственный декапептид, ILDTAGKEEY. В дальнейшем мы подтвердили полученные результаты путем сравнения идентификационных спектров ILDTAGKEEY и синтетического пептида.

Примечательно, что ILDTAGKEEY и родственный ему ILDTAGREEY оказались прогнозируемыми пептидами с самыми высокими показателями для RAS.Q61K и RAS.Q61R, соответственно (в контексте HLA-A*01:01). Мы дали количественную оценку презентации неопептидов в нашей системе сверхэкспрессии и подтвердили презентацию RAS.Q61R-обусловленного ILDTAGREEY с помощью высокочувствительной абсолютной таргетной масс-спектрометрии. ILDTAGKEEY и ILDTAGREEY обнаружились в количестве 3,2850 и 38,2375 амоль на 1×106 клеток для 721.221A*01:01;mRAS.Q61K и 721.221A*01:01;mRAS.Q61R, соответственно.

ILDTAGKEEY в большом объеме присутствует в HLA-A*01:01/RAS.Q61K-экспрессирующих опухолях

Чтобы дополнительно подтвердить полученные результаты в контексте злокачественности и в условиях эндогенной экспрессии мутаций и HLA, мы произвели HLA-пептидомику линии опухолевых клеток 17T. Так как предыдущие полноэкзомные исследования в нашей лаборатории позволили идентифицировать меланому 17T как NRAS.Q61K-мутанта, а HLA-типирование определило ее как HLA-A*01:01+, мы использовали масс-спектрометрию в режиме обнаружения в целях беспристрастной идентификации неоантигенов вне зависимости от прогнозирования или прошлых идентификаций. База данных для масс-спектрометрии состояла из нормальных для человеческого протеома последовательностей и из последовательностей мутировавших белков, выявленных по результатам полноэкзомного секвенирования 17T. И действительно: из 2356 пептидов удалось выявить единственный неопептид – декапептид ILDTAGKEEY.

Чтобы изучить устойчивость презентации, мы создали панель из 4 быстрозамороженных опухолей и 5 дополнительных линий опухолевых клеток. Вся панель эндогенно экспрессировала комбинацию HLA-A*01:01/NRAS.Q61K. Мы включили в анализ Hs940T, клеточную линию меланомы HLA-A*01:01/NRAS.Q61R, для одновременного тестирования на эндогенную презентацию ILDTAGREEY. Все клеточные линии прошли валидацию как экспрессирующие мутантные NRAS-транскрипты.

HLA-пептидомика с применением высокочувствительной абсолютной таргетной MS позволила выявить неопептид ILDTAGKEEY во всех NRAS.Q61K-мутантных образцах в количествах, варьирующихся от 0,1250 до 2,9138 амоль на 1×106 клеток при расчете 1×108 клеток на 1 мг опухолевой ткани. Как и ожидалось, мы обнаружили у Hs940T ILDTAGREEY. Важно отметить, что клеточная линия HuT78 из нашей панели была извлечена из T-клеточной лимфомы, что свидетельствует о релевантности идентифицированных антигенов для различных видов рака.

Мы заключили, что ILDTAGKEEY – это устойчивый, обрабатываемый естественным образом, RAS.Q61K-обусловленный неопептид, представленный в контексте HLA-аллеля A*01:01.

Мутантный лизин HLA-A*01:01/ILDTAGKEEY способен свободно взаимодействовать с T-клеточными рецепторами

Известно, что WT ILDTAGQEEY связывается с HLA-A*01:01, из чего можно сделать вывод о том, что мутантный лизин способен взаимодействовать с T-клеточными рецепторами. Мы закрепили боковые цепи ILDTAGKEEY и ILDTAGQEEY на каркасе ранее растворенной кристальной структуры декапептида HLA-A*01:01/ALK (Protein Data Bank [PDB]: 6at9) и произвели забор образцов конформации при помощи 5 независимых траекторий молекулярной динамики (MD) на комплекс и бесплатных интерфейсов веб-серверов FlexPepDock, ClusPro и DINC.

Результаты анализа водородной связи указали на схожее взаимодействие мутантных и WT-вариантов с HLA-A*01:01. Водородные связи наблюдались между HLA-рецепторами для WT- и мутантных вариантов на позиции 3 (P3) и на C-конце (PΩ), как и ожидалось. И напротив: P7 (остаток 61) сформировал меньше водородных связей с HLA-рецептором. Несмотря на то, что каркас P7 во время стимуляции оставался внутри пептид-связывающей бороздки, боковая цепь подвергалась воздействию растворителя и была направлена к поверхности напротив T-клеточного рецептора. Такое структурное моделирование подразумевает, что остаток 61 направлен наружу из HLA-кармана и способен взаимодействовать с TCRs, поддерживая тем самым дифференциальную иммуногенность мутантных и WT-пептидов.

HLA-A*01:01/ILDTAGKEEY является иммуногенным

Мы использовали TIL-продукты 17TIL/135TIL, родственные клеточным линиям меланомы 17T и 135T из нашей панели, соответственно, чтобы изучить иммуногенность идентифицированного неоантигена RAS.Q61K. Как уже продемонстрировал киллинг-анализ на базе GFP, эти TIL-продукты способны уничтожать родственные клетки меланомы.

Чтобы отличить неоантиген-специфическую реактивность от общей реактивности, мы произвели количественную оценку выброса интерферона-гамма TIL-продуктами в ответ на пептид-активированные, HLA-A*01:01+-презентирующие клетки. B-лимфобластоидные клеточные линии (B-LCLs) активировались либо проводником DMSO, либо WT (ILDTAGQEEY) или мутантными (ILDTAGKEEY или ILDTAGREEY) синтетическими пептидами с последующей ночной инкубацией с 17TIL либо 135TIL и – в дальнейшем – с IFN-γ ELISA коинкубационной среды.

RAS.Q61K стимулировал выброс интерферона-гамма одновременно в 17TIL и 135TIL, в то время как вариант дикого типа не вызвал существенного повышения в сравнении с неактивированной контрольной линией B-клеток. Примечательно: несмотря на то, что 17T не является мутантом RAS.Q61R, у 17TIL обнаружилась кросс-реактивность с RAS.Q61R. Анализ титрования пептидов подтвердил дозозависимую реактивность с HLA-A*01:01/ILDTAGKEEY и для 17TIL, и для 135TIL.

Проточная цитофлуориметрия выявила преобладающие клетки CD4+ у 17TIL (58–80%) и CD8+ у 135TIL (90%). Анализ секреции IFN-γ на базе проточной цитометрии и окрашивание тетрамеров позволили обнаружить неаонтиген-специфические субпопуляции. Неоантиген-специфическая секреция интерферона-гамма наблюдалась в 0,93% и 1,94% CD4– TILs в 17TIL и 135TIL, соответственно, после ко-инкубации с пептид-активированными B-LCLs (P < 0,00001 в обоих случаях, критерий хи-квадрат, 10 мкг/мл пептида).

При окрашивании тетрамеров HLA-A*01:01/ILDTAGKEEY 5,2% и 3,2% клеток CD8+ связывались с RAS.Q61K в 17TIL и 135TIL, соответственно (1,46% и 2,8% от общих TILs, соответственно). Анализ пролиферации в 17TIL продемонстрировал неоантиген-зависимую экспансию (P < 0,00001, хи-квадрат). Более того: одновременное окрашивание TILs с HLA-A*01:01/ILDTAGREEY-тетрамером подтвердило кросс-реактивность 17TIL в таком варианте и факт того, что большинство (76%) из HLA-A*01:01/ILDTAGKEEY-связывающих клеток вступают в перекрестную реактивность с аргинин-замещенным пептидом. Субпопуляции CD8–, как и ожидалось, не окрасились тетрамером.

Таким образом, мы продемонстрировали специфическую реактивность TIL в отношении HLA-A*01:01/ILDTAGKEEY у двух неродственных пациентов, у одного из которых обнаружилась кросс-реактивность в отношении HLA-A*01:01/ILDTAGREEY. Соответственно, мы заключаем, что оба этих неоантигена являются иммуногенными.

Выявление неоантиген-связывающих TCR-цепей

TCRs, воздействующие на HLA-A*01:01/ILDTAGKEEY, обладают трансляционной ценностью; адоптивный перенос модифицированных T-клеток с использованием таких TCRs предположительно будет эффективен для 3% пациентов с меланомой и для 2,9:1000 пациентов с онкологическими заболеваниями всех типов. Мы произвели секвенирование РНК T-клеточных рецепторов на TILs, отобранных по тетрамеру, с тем, чтобы идентифицировать релевантные α- и β-цепи.

Для 17TIL и 135TIL мы произвели индивидуальное секвенирование трех клеточных популяций: общей CD4– и ее A*01:01/ILDTAGKEEY-тетрамер+ и тетрамер– субпопуляций. Мы сопоставили репертуары тетрамер+ и тетрамер-, чтобы извлечь тетрамер-обогащенные (т.е., тетрамер-специфические) цепи, в то время как секвенирование общей клеточной популяции позволило поместить эти цепи в контекст. Наши эксперименты по сортировке и секвенированию (3 параллельных биоанализа) отличались высокой степенью системности. Несмотря на то, что каждый эксперимент по секвенированию выявил от нескольких сотен до нескольких тысяч отдельных, продуктивных TCR-цепей, и в 17TIL, и в 135TIL явно наблюдалась олигоклональная дистрибуция.

Если ограничить выборку последовательностями аминокислот, отражающими не менее 1% транскриптов, 11 β (13 α) цепей преобладали в CD4– репертуаре 17TIL с совокупным покрытием 76,5% (69,6%) транскриптов. Аналогичным образом, в случае 135TIL 6 β (7 α) цепей составили 92,5% (93,6%) от CD4– репертуара. Для субпопуляций тетрамер+ и тетрамер- также были характерны олигоклональные дистрибуции T-клеточных рецепторов. Когда в дальнейшем мы сосредоточились на TCR-цепях с по меньшей мере 100-кратным обогащением частоты транскриптов тетрамер+/тетрамер–, 4 β- и 6 α-цепей оказались неоантиген-специфическими в 17TIL.

Совокупная частота этих 4 β-цепей составила 69,6%, 3% и 0,005% в тетрамер+, общей CD4– и тетрамер- популяциях, соответственно. Аналогично, совокупная частота 6 α-цепей составила 83,8%, 6,8% и 0% в тетрамер+, общей CD4– и тетрамер- популяциях, соответственно. В 135TIL вышеперечисленным критериям соответствовала единственная пара αβ с частотой в 89,9% и 85,2% в тетрамер+ 135TIL. Такие цепи составили всего лишь 2,9% и 2,8% от общего CD4– α и β 135TIL репертуаров, соответственно. Примечательно, что дистрибуции частот α и β оказались достаточно устойчивыми для того, чтобы можно было допустить научную догадку в отношении сопряжения цепей на базе общего секвенирования T-клеточных рецепторов.

Характеристика TCR-репертуара на основе одиночных клеток

Чтобы подробнее исследовать эти TCR-репертуары и выявить тетрамер-связывающие αβ-соединения, мы произвели TCR-секвенирование одиночных клеток. В течение ночи мы ко-инкубировали TILS и первоначальные клетки меланомы (т.е., 17TIL с 17T, 135TIL с 135T), после чего разделили образцы на интересующие популяции и перешли к двойному секвенированию РНК и TCR-секвенированию одиночных клеток с применением платформы 10x Genomics. Как и в эксперименте с массовым секвенированием, мы сосредоточились на трех популяциях TIL: общей CD8+ и ее HLA-A*01:01/ILDTAGKEEY-тетрамер+ и тетрамер– субпопуляциях. Мы снова использовали метод обогащения частот тетрамер+/тетрамер- с тем, чтобы исследовать именно тетрамер-специфические клоны.

Как ожидалось, результаты массового секвенирования и секвенирования одиночных клеток оказались высокостабильными. Мы идентифицировали клоны 343 и 44 клона CD8+ в 17TIL и 135TIL, соответственно, с преобладанием небольшого набора клонов в репертуаре CD8+. Используя те же критерии фильтрации как минимум 100-кратного обогащения и клональной экспансии по меньшей мере 1% тетрамер+ клеток, мы выявили три ведущих тетрамер-специфических клона в 17TIL и единственного клона в 135TIL. Эти тетрамер-специфические клоны составили всего лишь 5,1% и 2,2% от CD8+ клеток в 17TIL и 135TIL, соответственно, причем на долю доминантного клона приходилось свыше 70% тетрамер-обогащенной подгруппы. Важно отметить, что пары цепей, являвшиеся нашими кандидатами и полученные по итогам массового секвенирования T-клеточных рецепторов, подтвердились по результатам секвенирования одиночных клеток.

Номенклатура клонов и TCR-цепей

Тетрамер-специфические клоны здесь и далее определяются как клоны одиночных клеток с по меньшей мере 100-кратным обогащением тетрамер+/тетрамер- частот и в экспериментах по секвенированию одиночных клеток, и в экспериментах по массовому секвенированию T-клеточных рецепторов. В частности, клон считался тетрамер-обогащенным в соответствии с результатами массового секвенирования TCR в случае, если все его TCR-цепи являлись тетрамер-обогащенными по меньшей мере в 1 из 3 параллельных анализов массового секвенирования.

Такая фильтрация позволила сохранить суммарно 15 тетрамер-специфических клонов. В 6 из них субпопуляции тетрамер+ принадлежало более 5 клеток. Соответственно, мы аннотировали такие клоны как N{TIL: 17/135}.{номер клона} в порядке убывания частоты.

В целях функциональной валидации мы сосредоточились, как указано выше, на клонах, по меньшей мере на 1% состоящих из тетрамер-специфического репертуара. Это относилось к первым трем клонам в 17TIL — N17.1, N17.2 и N17.3 – и к единственному доминантному тетрамер-специфическому клону в 135TIL, N135.1. N17.2, N17.4 и N135.1 – это αβ клетки; N17.3 – ααβ. По итогам стандартного анализа процессов N17.1 является клоном αβ. Тем не менее, как объясняется ниже, этот клон в действительности имеет вторую α-цепь, переставленную местами с δ-геном TRDV1.

Соответствующие TCR-цепи вышеперечисленных клонов указываются следующим образом: N{тип цепи: A/B}{TIL: 17/135}.{номер клона}.{номер цепи [если таковой предусмотрен]}. TCR-продукты αβ-клонов имеют то же наименование, что и клон (т.е., TCR N17.2 – это комбинация NA17.2 и NB17.2); в случае ααβ-клеток TCR-наименование определяется путем дифференциации α-цепи (т.е., TCR N17.1.2 – это комбинация NA17.1.2 и NB17.1).

Конвергенция индивидуальных и межиндивидуальных последовательностей неоантиген-специфических TCR

Последовательности аминокислот тетрамер-специфических TCR выявили схожесть в TCR разных пациентов между N17.3, N17.5 и N135.1: в β-цепях имелись участки CDR3 по 11 аминокислот с расстоянием Хэмминга 1-3 между ними и V/J-гены того же семейства (TRBV6-1 или TRBV6-6, TRBJ1-1). Альфа-цепи также оказались схожими, с расстоянием Хэмминга 2-4 между их CDR3 длиной 16 аминокислот, общим V-геном (TRAV19), и одинаковым J-геном (TRAJ39) в 2 цепях. Ограничив расстояние Хэмминга тремя и менее одинаковыми семействами V/J-генов, мы как ни удивительно, обнаружили 2 низкочастотные α-цепи и 1 β-цепь, схожие с NA135.1 и NB135.1, соответственно.

Более того: наш эксперимент с одиночными клетками подтвердил соединение этих цепей и образование двух дополнительных клонов, напоминающих N135.1. Пользуясь теми же принципами присвоения имен, что и раньше, мы назвали эти клоны N17.6 и N17.7 притом, что N17.5 и N17.6 разделяют одну последовательность β-цепи. Несмотря на меньшую частоту в репертуаре, дополнительные клоны оказались тетрамер-специфическими.

Подводя итог вышесказанному, мы обнаружили конвергентный класс из 5 тетрамер-специфических клонов. Два таких клона, N17.3 и N135.1, уже выбирались в целях функциональной валидации на основании их частоты. Мы добавили самый частый T-клеточный рецептор, выбранный по тем же принципам (N17.5, состоящий из 7 клеток по итогам секвенирования одиночных клеток), в наш эксперимент по валидации TCR.

Валидация и описание неоантиген-связывающего репертуара TCR

Выявив множественные тетрамер-специфические клоны T-клеток, мы попытались обосновать их индивидуальную чувствительность и специфичность в отношении неоантигена HLA-A*01:01/ILDTAGKEEY.

В этих целях мы индуцировали сверхэкспрессию интересующих нас αβ-комбинаций в здоровых донорских периферических T-клетках. Эксперименты со связыванием тетрамеров подтвердили связывание неоантигенов для N17.2, N17.5 и N135.1 и позволили выявить релевантную αβ-комбинацию для ααβ-клона N17.3 (NA17.3.2/NB17.3). Удивительно, но αβ-пара, относящаяся к наиболее выдающемуся из тетрамер-специфических клонов 17TIL, N17.1, не прошла валидацию даже несмотря на свою эффективную экспрессию.

Клональная экспрессия δ-гена TRDV1 в этом клоне, наблюдаемая по итогам РНК-секвенирования одиночных клеток, привела нас к необходимости повторно изучить результаты TCR-секвенирования и позволила обнаружить вторую α-цепь N17.1, NA17.1.2, образующуюся вследствие нечастого события – рекомбинации TRDV1/TRAJ27. NA17.1.2 удалось выявить в частоте, эквивалентной частоте NA17.1.1 по итогам массового TCR-секвенирования (40,4–54,9% и 25,6–41,3%, соответственно), и обнаружить в 99,1% (2905 из 2930) клеток N17.1 по итогам анализа одиночных клеток. Повторный анализ данных, полученных по итогам TCR-секвенирования, позволил выявить 2 дополнительные TRDV1-α-цепи в 17TIL и 5 таких цепей в 135TIL. Ни один из других генов TRDV не участвовал в перестановке α-цепи. Как и ожидалось, комбинация цепей NA17.1.2/NB17.1, обозначаемая как N17.1.2, прошла валидацию по итогам окрашивания тетрамера.

Мы перешли к ко-инкубации различных TCR-модифицированных T-клеток с HLA-A*01:01+ B-LCLs, активированными либо неопептидом ILDTAGKEEY, либо его вариантом дикого типа в разных концентрациях. Все 5 протестированных T-клеточных рецепторов оказались неоантиген-специфическими, что подтверждается их дифференциальной реактивностью в отношении мутировавшего пептида в супрафизиологических концентрациях.

Эксперименты с титрованием пептида позволили установить, что эти TCRs потенциально распознают пептид ILDTAGKEEY в концентрациях от 0,01 нм до 10 нм. Примечательно, что нам довелось наблюдать обратное взаимоотношение между частотой TCR и чувствительностью в 17TIL.

Чтобы подробнее изучить реактивность и цитотоксические свойства T-клеточных рецепторов в отношении эндогенно экспрессируемого неоантигена, мы ко-инкубировали TCR-модифицированные T-клетки с линиями опухолевых клеток HLA-A*01:01+NRAS.Q61K+. Тестирование двух наиболее мощных T-клеточных рецепторов, N17.1.2 и N17.2, в рамках анализа реактивности и сравнения с панелью опухолевых клеток дало те же результаты, что и иммунопептидомика. Более того: мы наблюдали значительную апрегуляцию 4-1BB после ко-инкубации с HLA-A*01:01+KRAS.Q61K+ клеточной линией аденокарциномы легкого Calu6, подтверждающую перекрестную изоформную и перекрестную раковую релевантность неоантигена HLA-A*01:01/ILDTAGKEEY согласно прогнозам. Все 5 протестированных T-клеточных рецепторов обладали цитотоксическими свойствами по отношению к неоантиген-экспрессирующей меланоме, что видно по анализу расщепленной каспазы-3.

Так как большинство тетрамер-связывающих 17TIL также перекрестно связываются с HLA-A*01:01/ILDTAGREEY-тетрамером, мы предположили, что именно N17.1.2 обладает двойной реактивностью. Примечательно также, что N17.1.2 действительно распознает неопептид ILDTAGREEY даже в концентрации 1 нм. Мы подтвердили, что оставшиеся 4 TCRs не распознают неопептид ILDTAGREEY.

Проблемы генерации T-клеточных рецепторов для кластера неоантиген-специфического сходства

Как указано выше, T-клеточные рецепторы из кластера сходства N17.5 и N17.6 имеют идентичную β-цепь. Интересно, что последовательность CDR3 цепи NB17.5, CASSQNTEAFF, фактически является «публичной», так как обнаруживается в 696 (из 786) образцах по данным Эмерсона. Важно, впрочем, отметить, что несмотря на возможность получения такой же последовательности CDR3 с помощью 39 разных TRBV-генов (конвергентная рекомбинация) про данным Эмерсона, исходя из наших данных указанная последовательность рекомбинировалась только из TRBV6-6.

С учетом этой информации и консервации TRBV6 во всех T-клеточных рецепторах из кластеров сходства мы выдвинули гипотезу о том, что TRBV6 обладает функциональной значимостью за пределами участка CDR3 в отношении этого конвергентного неоантиген-специфического класса. 30% HLA-аннотированных CASSQNTEAFF+ образцов в данных Эмерсона содержат HLA-аллель A*01:01 (189 против 440). Статистического повышения рекомбинации с TRBV6-6 (или TRBV6) для этой подгруппы образцов не наблюдалось (точный тест Фишера, P = 0,45). Несмотря на сходство с NB17.5, у всех остальных β-цепей конвергентного класса обнаружились низкие уровни распределения по Эмерсону.

Планирование вероятностей генерации (обозначаемых в данной работе Pgen) клонов конвергентного класса может стать источником ценной информации. Для двух наших наиболее перспективных T-клеточных рецепторов, N17.1.2 и N17.2, характерна низкая Pgen в отношении как α-, так и β-цепей. N17.5 и N17.6 превзошли другие рецепторы в Pgen(β), как и ожидалось от публичного клонотипа. Из всей группы наиболее высокая Pgen(α) отмечалась у N135.1.

С точки зрения генной инженерии интересно выяснить, являются ли некоторые из α/β-цепей взаимозаменяемыми. NH1 (NA135.1/NB17.5) – это гипотетический клон, который максимизирует Pgen одновременно для α и β в кластере сходства. Мы проверили NH1 на реактивность к антигенам, и он прошел валидацию и путем окрашивания тетрамером, и путем выброса неоантиген-специфического интерферона-гамма. Обратная комбинация, NA17.5/NB135.1, также прошла валидацию, в то время как транспозиция цепи N17.3.2 с N17.5 или N135.1 не сохранила неоантигенной специфичности.

Профилирование CD8+ 17TIL и 135TIL на основе одиночных клеток

Далее мы предприняли попытку изучить транскрипционный профиль неоантиген-специфических клонов в рамках ответа на меланому и сравнить их клеточные состояния с другими популяциями CD8+ TIL. Вкратце, мы в течение ночи ко-инкубировали общие 17TIL и 135TIL с клеточной линией меланомы в соотношении 1:1, распределили их в массовые популяции CD8+, CD8+ тетрамер+ и CD8+ тетрамер– T-клеток и произвели профилирование с использованием РНК-секвенирования спаренных одиночных клеток и TCR-секвенирования на платформе 10x Genomics.

После фильтрации по качеству на основе TCR-цепей, количества UMIs и процентного соотношения митохондриальных показателей на клетку мы получили 14012 клеток из рассортированных массовых популяций CD8+ клеток (3815 клеток в общих 17TIL; 10197 клеток в общих 135TIL). Чтобы составить обзор общего ландшафта CD8+ TIL, мы интегрировали эти общие популяции и произвели безнадзорную кластеризацию, которая позволила выявить 10 фенотипических кластеров (общие кластеры BC1-10), включая цитотоксический кластер (3275 клеток), экспрессирующий высокие уровни GNLY, NKG7 и GZMH. Мы также идентифицировали кластер из 1708 клеток, экспрессирующих маркеры ранней активации, включая IL7R, FOS, TCF7 и SLAMF6, и демонстрирующих сходство с генными сигнатурами клеток-предшественников из прошлых исследований (BC3) – в том числе с CD39–CD69–дважды-негативной сигнатурой, ассоциированной с эффективным клиническим ответом на адоптивный клеточный перенос и блокаду контрольных точек иммунного ответа.

BC4 дифференциально экспрессировал смесь маркеров активации, включая IFNG, TNFRSF9 (4-1BB), TNF (TNF-α), ENTPD1 (CD39), CD69, и такие гены ингибирования контрольных иммунных точек, как HAVCR2 (TIM-3), PDCD1 (PD-1), TIGIT и LAG3. Кроме того, BC4 демонстрировал транскрипционный перехлест с подтвержденными сигнатурами истощения.

Общий CD8+ T-клеточный ландшафт содержал кластер постоянных клеток, схожих с клетками памяти и экспрессирующих ITGAE, CXCR6 и ENTPD1 (CD39), а также два кластера пролиферирующих клеток, экспрессирующих высокие уровни генов, связанных с клеточным циклом G2M/S, включая MKI67, TOP2A и TUBA1B. Вывод об одинаковых клеточных состояниях и эффективной интеграции данных можно сделать на основании того факта, что при кластеризации 17TIL и 135TIL не попали в отдельные кластеры. Тем не менее, в 17TIL обнаружилась повышенное соотношение рано активированных (BC3) и активированных/истощенных (BC4) клеток, что указывает на пациент-специфические фенотипические различия между общими популяциями CD8+ T-клеток.

Чтобы сосредоточить анализ на действительных тетрамер-обогащенных клонах, мы отфильтровали 17TIL и 135TIL CD8+ тетрамер+ популяции, как указано выше, и включили в анализ только тетрамер+/тетрамер– частотно-обогащенные клоны, содержащие по меньшей мере 5 клеток (т.е., N17.1-5, N135.1), в дополнение к клонам, идентифицированным через сходство TCR (N17.6, N17.7). Таким образом, мы получили 3679 и 2178 клеток из 7 клонов и единственного клона в тетрамер+ популяциях 17TIL и 135TIL, соответственно. Эти тетрамер-обогащенные клоны также обнаруживались в общей популяции, хоть и с гораздо меньшей частотой, за исключением N17.5, N17.6 и N17.7, которые не удалось выявить в общем образце.

Чтобы сравнить транскрипционные состояния этих тетрамер-обогащенных клонов в более обширном CD8+ ландшафте, мы интегрировали отфильтрованные 17TIL и 135TIL тетрамер+ образцы в общие CD8+ образцы, ориентируясь по общим популяциям. Безнадзорная кластеризация тетрамер-обогащенных и общих TILs сгенерировала профиль фенотипической кластеризации, очень похожий на профиль одних только общих CD8+ популяций. Таким образом, аннотации BC-кластера сохранялись и в рамках интегрированного массового и тетрамер-обогащенного анализа.

Сравнив фенотипические пропорции между тетрамер-обогащенными и общими популяциями, мы обнаружили, что и 17TIL и 135TIL тетрамер-обогащенные популяции существенно обогащаются активированными/истощенными фенотипами. Более того: 17TIL тетрамер-обогащенная популяция чаще преобладала в постоянном кластере памяти по сравнению с 17TIL общей CD8+ популяцией. И напротив: в тетрамер-обогащенных клеточных популяциях отмечалась деплеция рано активированных и цитотоксических фенотипов в сравнении с общими популяциями. Тем не менее, все часто репрезентируемые неоантиген-специфические клоны (N135.1, N17.1, N17.2, N17.3 и N17.4) содержали клетки из кластера ранней активации, что связано с состоянием CD39–CD69– клеток-предшественников.

Примечательно, что доминантный и чувствительный клон N17.1 содержал наименьшую пропорцию рано активированных клеток: только 1,3% клеток клона принадлежало к группе BC3. В совокупности эти результаты указывают на то, что несмотря на более зрелое активированное и/или истощенное состояние неоантиген-специфических клонов в сравнении с другими CD8+ клонами, неоантиген-специфические клоны могут отличаться по степени зрелости, потенциально отражающей их экспансию и функциональные возможности.

Чтобы подробнее охарактеризовать и сравнить фенотипические состояния отдельных неоантиген-специфических клонов, мы отдельно проанализировали тетрамер-обогащенные клеточные популяции. Безнадзорная кластеризация 17TIL и 135TIL тетрамер-обогащенных клеточных популяций позволила выявить 7 кластеров (неоантигенные кластеры, NC1-7), включавших клоны от обоих пациентов и не взаимодействующих непосредственно с фенотипическими кластерами, полученными от интеграции общих образцов.

NC2 дифференциально экспрессировал маркеры активации, включая IFNG, TNFRSF9 (4-1BB) и TNF, а также связанные с цитотоксичностью гены, включая NKG7. NC1 и NC3 также экспрессировали гены цитотоксичности NKG7 и GNLY, хотя их клеточные состояния были менее определенными. Несмотря на фенотипические сходства NC4 с активированным эффектороподобным NC2 (т.е., несмотря на экспрессию NKG7, TNFRSF9 и IFNG), он экспрессировал более высокие уровни определенных ингибиторных рецепторов, включая HAVCR2 (TIM-3) и TIGIT, из чего можно сделать вывод о том, что клетки в этом кластере могут существовать в более истощенном состоянии, что подтверждается ассоциацией с установленными сигнатурами истощения. NC6 состоял из клеток, экспрессирующих смесь рано активируемых генов TCF7, SLAMF6 и FOS и маркера памяти KLRB1, и демонстрировал самую высокую степень корреспондирования с сигнатурами стволовых клеток и памяти, описанную в литературе.

Картирование клональных данных T-клеточных рецепторов с учетом результатов фенотипической кластеризации позволило обнаружить сильную транскрипционную связь между клетками с одинаковым клоном несмотря на исключение TCR-клонов из процесса снижения многомерности и кластеризации. В частности, клетки N17.1 преимущественно содержались в NC1-3, в то время как N17.2 в большей степени ограничивались NC4. Менее частые (N17.3, N17.4) и чувствительные (N17.3), хорошо репрезентируемые клоны в основном состояли из клеток с рано активируемым NC6.

Наблюдение касательно того, что разные клоны при столкновении с одним и тем же неоантигеном переходили в явные клональные состояния, может указывать на индукцию дифференциальных T-клеточных состояний уникальными характеристиками специфического взаимодействия между T-клеточным рецептором и неоантигеном. И напротив: N135.1 распределился по всем кластерам. Так как в разных опухолях отмечается разная презентация одного и того же неоантигена, как мы уже продемонстрировали в случаях с 17T и 135T, сложно определить, каким является широкий спектр фенотипов в N135.1: естественным для TCR и/или неоантиген-зависимым. Интересно отметить, что N17.5, схожий с N135.1 в отношении как последовательности, так и функции, также перешел в диспергированное фенотипическое состояние сразу в нескольких кластерах, хотя его низкая репрезентация и маленький размер клонов (7 клеток) препятствуют дефинитивным выводам.

Чтобы сравнить степени активации, мы сопоставили неоантиген-специфических клонов, 3 общих клона с наибольшей экспансией и скопление всех неэкспансированных клонов (общие клоны размером в 1 клетку) на основании установленной генной сигнатуры активации T-клеток. Как ни странно, 17TIL неоантиген-специфические клоны отличались высокими уровнями активации в сравнении с наиболее экспансированными общими клонами несмотря на частоту на несколько порядков ниже общей TIL популяции. В соответствии с иерархией чувствительности, обозначенной в рамках наших экспериментов с титрованием пептидов, клетки N17.1 в среднем присутствовали в максимально активированном состоянии.

За N17.1 следовали клетки N17.2, в то время как в N17.3 и N17.4 отмечались сопоставимые уровни низкой активации. Несмотря на то, что N17.5 содержит клетки с высокими показателями активации, ее низкая клональная частота и широкий спектр показателей активации в одном клоне препятствуют любой значимой интерпретации паттерна ее активации. Неэкспансированные клоны 17TIL коллективно продемонстрировали гораздо более низкие показатели активации по сравнению с неоантиген-специфическими клонами или наиболее экспансированными общими клонами.

Несмотря на меньшую вариабельность в уровнях активации клонов из 135TIL популяции, нам удалось выявить схожий паттерн, согласно которому неоантиген-специфический клон N135.1 отличался от второго и третьего общих клонов с наибольшей экспансией гораздо более высокими показателями активации притом, что на его долю приходилось всего лишь 2,2% от общей 135TIL популяции (P < 0,001 при использовании сигнатуры активации и маркеров индивидуальной активации FN-γ, 4-1BB, TNF-α и CD69; T-критерий Уилкоксона с поправкой Бонферрони на множественную проверку гипотез). Эти тенденции наблюдались и при анализе уровней экспрессии таких маркеров индивидуальной активации, как IFNG и TNFRSF9 (4-1BB).

Важно отметить, что и 17TIL, и 135TIL экспансировались in vitro с применением протокола быстрой экспансии (REP), иногда искажающего нативные клональные частоты. Более того: возможно, что клеточные линии 17T и 135T не презентируют определенные антигены, доминирующие в изначальных опухолях и потенциально распознаваемые наиболее экспансированными клонами опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов.

Чтобы сгенерировать клон-специфические генные сигнатуры, мы произвели дифференциальный анализ генной экспрессии между тетрамер-обогащенными клонами из 17TIL и 135TIL с размером клона более 5 клеток. N17.1 продемонстрировал высокие уровни экспрессии LAIR2, TNFRSF9 (4-1BB) и нескольких молекул хемокинов, включая CCL3, CCL4, CXCL8 и CCL4L2. Эти гены также экспрессировались N17.2 и N17.5, причем последний дополнительно экспрессирует высокие уровни KLRB1 и иммуноглобулин-подобного рецептора клеток-киллеров KIR2DL3.

Генные сигнатуры N17.3 и N17.4 отличались высокой согласованностью: оба клона избыточно экспрессировали REG4, CD27 и SPOCK2, в то время как N135.1 демонстрировал явную генную сигнатуру, состоящую из RARRES3, CCL5 и GZMA. Кластеризация неоантиген-специфических клонов, основанная на этих клон-специфических генных сигнатурах, позволила обнаружить, что N135.1 действительно транскрипционно менее схож с другими клонами 17TIL. Среди 17TIL неоантиген-специфических клонов обнаружились 2 кластера высокой корреляции: один кластер с N17.1, N17.2 и N17.5 и второй с N17.3 и N17.4, что соответствует их общей генной сигнатуре и паттернам показателей активации. Примечательно, что нам не довелось наблюдать среди клонов со схожими последовательностями TCR тенденции к кластеризации согласно фенотипическому профилю.

Выводы

Выявление рекуррентных неоантигенов, презентируемых опухолями и распознаваемых T-клетками, является основной проблемой в применении надежных и эффективных средств противораковой иммунотерапии на практике. Выявление антигенов преимущественно осуществляется с применением подходов, основанных на сверхэкспрессии интересующих неопептидов в APCs и оценке их реактивности с использованием TILs с подходящими HLA. Такая методика позволила выявить множество иммунореактивных неопептидов.

Вместе с тем у данного подхода есть два основных недостатка:

(a) так как выявление неопептидов основывается на реактивности T-клеток, нельзя достоверно определить, действительно ли этот неоантиген присутствует в опухолевых тканях пациента;
(b) большинство выявленных неоантигенов являются частными, и это ограничивает их активное применение в клинических условиях.

Не считая нескольких рекуррентных неоантигенов, обнаруженных по счастливой случайности, эксперты использовали вышеперечисленные методы для непосредственного поиска таких антигенов. Выбор образцов для исследований преимущественно осуществлялся на основании либо конкретных рекуррентных мутаций, либо частоты HLA-аллелей в клеточной популяции. Тем не менее, применимость рекуррентного неоантигена в масштабах популяции зависит от продуктивности их взаимодействия. Рекуррентная мутация может произвести редкий неоантиген при сочетании с редким HLA-аллелем – и наоборот.

Учитывая эти ограничения, мы разработали новый подход, который повышает вероятность обнаружения и презентируемых, и рекуррентных неопептидов. Насколько нам известно, это первое исследование с применением такого подхода, в рамках которого при анализе данных используется как база данных рецидивирующих мутаций, так и информация о HLA-аллотипах пациентов, являющихся носителями таких мутаций. Подобный анализ позволил точно и рационально выбрать кандидатов для проверки на презентацию рекуррентных неопептидов.

Более того: мы непосредственно продемонстрировали презентацию неоантигенов. Чтобы без предубеждения исследовать пространство неопептида-кандидата, мы индуцировали ко-сверхэкспрессию релевантного минигена и HLA-комбинации и изучили ее напрямую с помощью HLA-пептидомики. Такой подход не только позволил довести до максимума презентацию неопептида, но и устранил потребность в труднодоступных опухолевых образцах в ранней фазе скрининга. После валидации конкретного пептида мы переходили к проверке его стабильной презентации в контексте злокачественности.

Чтобы получить больше возможностей, мы произвели HLA-пептидомику в таргетном порядке с использованием тяжелых синтетических пептидов, внедренных в образец для HLA-пептидомики. Это не только повысило чувствительность процесса, но и позволило произвести приблизительную оценку концентрации интересующего нас эндогенного пептида.

Работая в лаборатории, ориентированной на лечение меланомы, и в свете терапевтических преимуществ иммунотерапии конкретно для пациентов с меланомой мы решили посвятить вышеперечисленные эксперименты мутациям, часто встречающимся при меланоме. NRAS-мутантная меланома хорошо известна своим неблагоприятным прогнозом. В отличие от BRAF-мутантной меланомы, опухоли этого подтипа пока не поддаются таргетной терапии.

Несмотря на то, что пациенты с NRAS-мутациями больше полагаются на иммунотерапию, доступные данные о преимуществах блокады контрольных точек иммунного ответа в их ситуации носят противоречивый характер. Соответственно, в рамках представленной работы мы сосредоточились на RAS.Q61, второй по частоте мутаций позиции при меланоме. Описанный нами алгоритм выявления неоантигенов можно легко обобщить и использовать при любых рецидивирующих мутациях; в настоящее время мы уже используем его в целях обнаружения дополнительных рекуррентных неоантигенов.

Применение такого подхода в отношении RAS.Q61 позволило сделать несколько важных наблюдений.

Во-первых, мы выявили NRAS.Q61K-обусловленный неопептид, часто презентируемый HLA-A*01:01 и демонстрирующий преимущества нашего подхода.
Во-вторых, мы показали, что NRAS.Q61K-обусловленный неопептид стабильно презентируется на злокачественных клетках.
В-третьих, мы продемонстрировали иммуногенность выявленного антигена с применением TILs от двух неродственных пациентов.
В-четвертых, TCR-секвенирование тетрамер+ TILs позволило выявить функциональные неоантиген-специфические TCRs, которые могут оказаться терапевтически релевантными вне индивидуального контекста.

Важно отметить, что наши результаты не ограничиваются мутацией NRAS.Q61K при меланоме. Последовательность ILDTAGKEEY отмечается и в вариантах RAS; таким образом, мы ожидали презентации неоантигена и от KRAS- и HRAS-мутантных опухолей. И действительно: наши результаты в HLA-пептидомике и анализах реактивности подтвердили, что HLA-A*01:01/ILDTAGKEEY неоантиген релевантен для различных видов опухолей и презентируется на KRAS-мутантной опухоли.

По прогнозам, основные варианты RAS.Q61 являются сильными связывателями HLA-A*01:01. И действительно: реактивность T-клеток в отношении HLA-A*01:01/ILDTAGREEY, варианта RAS.Q61R, ранее обнаружилась в TILs пациента с меланомой. Совокупная частота комбинаций HLA и мутаций A*01:01/NRAS.Q61K и A*01:01/NRAS.Q61R достигает 7% у больных меланомой.

Важно отметить, что обнаруженный нами доминантный, TRDV1-рекомбинированный TCR находился в перекрестном взаимодействии одновременно с RAS.Q61K и RAS.Q61R вариантами идентифицированного нами неоантигена, что увеличивает терапевтический потенциал наших выводов более, чем в два раза. И наконец, несмотря на сосредоточение нашей работы конкретно на HLA-аллотипе A*01:01, согласно прогнозам, наш пептид RAS.Q61K пусть и слабо, но должен связываться и с другими HLA-аллотипами. Дальнейшие исследования определят, связывают ли эти неопептиды прогнозируемые аллотипы.

Наша 3D структурная модель неопептид-HLA поддерживает потенциальное связывание и WT, и мутантных пептидов RAS.Q61 с HLA-A*01:01. Действительно, несмотря на невыявление в наших данных, существуют доказательства того, что пептид ILDTAGQEEY дикого типа обрабатывается и презентируется в HLA-A*01:01-экспрессирующих клеточных линиях. Вместе с тем наша структурная модель неопептид-HLA также прогнозировала, что мутировавшая аминокислота способна свободно взаимодействовать с T-клеточным рецептором. Таким образом, несмотря на возможную одновременную презентацию WT и мутантного пептидов, ожидается дифференциальная реактивность в отношении WT и мутантного пептидов. Ожидания подтвердились по результатам наших анализов реактивности, продемонстрировавших дозозависимую реактивность TIL конкретно в отношении мутанта, но не в отношении NRAS-пептида дикого типа.

Массовое TCR-секвенирование тетрамер-обогащенных TILs обеспечило нас TCR α- и β-последовательностями, с высокой вероятностью участвующими в неоантиген-специфических рецепторах. Схожее распределение частот α- и β-цепей указало на возможность конкретных комбинаций, подтвержденную TCR-секвенированием одиночных клеток. Более всего: все эти T-клеточные рецепторы прошли валидацию в качестве действующих и неоантиген-специфических.

Несмотря на то, что в прошлом больше всего внимания уделялось TCR-β-цепи, судя по итогам нашего анализа 2 неоантиген-специфических ααβ-клонов, α-цепь играет важную роль в обеспечении распознавания антигена.

Для обнаруженного нами неоантиген-специфического репертуара характерны существенные сходства TCR-последовательностей в индивидуальном и межиндивидуальном контексте. Эти сходства охватывают одновременно и α-, и β-цепи соответствующих T-клеточных рецепторов. Что касается их рекуррентного неоантигена HLA-C*08:02/RAS.G12D, Тран и соавторы также сообщили об идентичном TCR у двух неродственных пациентов. Эти статистически невозможные феномены напоминают «публичные» конвергентные последовательности, возникающие в определенных вирусных и аутоиммунных контекстах и заслуживающие более тщательного изучения, выходящего за рамки представленной работы.

Наш анализ неоантиген-специфических клонов на основе одиночных клеток подтвердил активацию, которую нам довелось наблюдать по итогам функциональных анализов. В целом в данных клетках отмечались повышенные пропорции истощения (BC4) и сниженные – ранней активации (BC3) в сравнении с общими TILs, что соответствует длительному воздействию антигенов.

Несмотря на то, что экспансия in vitro могла исказить изначальные частоты клонов, воздействие первичной меланомы позволило выявить неоантиген-специфические клоны даже среди наиболее экспансированных общих TIL клонов. При сопоставлении более крупные неоантиген-специфические клоны тяготели к более высоким уровням активации. В то время как пропорция рано активируемых клеток обычно уменьшалась по мере повышения чувствительности TCR, все часто репрезентируемые неоантиген-специфические клоны сохранили часть клеток BC3 после контакта с меланомой. Это важный факт, так как клетки BC3 схожи с недавно описанной сигнатурой стволовых клеток CD39–CD69–, необходимой для успешного адоптивного переноса.

Контрастирование неоантиген-специфических клеток внезапно привело к клональной сегрегации 17TIL, подчеркнув идею о том, что «клональные состояния» развиваются при уникальном взаимодействии T-клеточных рецепторов и опухоли. Хотя изучение такого отношения между TCR и неоантиген-индуцированными состояниями T-клеток не входит в задачи данной работы, оно может способствовать рациональной разработке адоптивной T-клеточной терапии, особенно в условиях обеспечения доступа к базам TCR, подобным той, что мы использовали для изучения неоантигена A*01:01/ILDTAGKEEY.

В отличие от 17TIL, N135.1 распределяется по всему алгоритму нелинейного снижения размерности UMAP. Более того: хотя клон N135.1 походит последовательностью TCR и функциональным профилем на некоторые неоантиген-специфические клоны в 17TIL, кластеризация на основе генных сигнатур позволила обнаружить, что транскрипционно он отличается от этих клонов. Это может быть связано с опухолевой частью равенства, так как мы продемонстрировали, что 17T и 135T дифференциально презентируют неоантиген. Кластеризация на основе генных сигнатур действительно столкнула наиболее активированные клоны (N17.1, N17.2, N17.5) с рано активируемыми клонами (N17.3, N17.4).

Примечательно, что LAIR2 дифференциально экспрессировался в высокоактивированных неоантиген-специфических клонах. Роль LAIR2 в опухолевой микросреде все еще не изучена до конца. Будучи секретируемым антагонистом LAIR1, LAIR2 доказанно индуцирует возбуждение иммунной системы и имеет связь с аутоиммунитетом. Недавно эксперты предположили, что экспрессия LAIR2 способствует истощению T-клеток через активацию CD8+ T-клеток и ассоциируется с неблагоприятным прогнозом при немелкоклеточном раке легких. Дальнейшую работу можно посвятить валидации секреции LAIR2 в неоантиген-специфических CD8+ клетках и исследованию ее иммуномодулирующей роли в опухолевой микросреде.

Новый комплекс позволил нам идентифицировать RAS.Q61K-обусловленный неопептид, рекуррентно презентируемый HLA-A*01:01. Так как NRAS.Q61K имеется у 3% пациентов с меланомой (2,9:1000 пациентов с любыми видами рака), а аллотип HLA-A*01:01 обнаруживается у 25% населения, это открытие релевантно для большой доли онкобольных.

Эти данные явно свидетельствуют о том, что результаты нашего анализа данных в когортах онкопациентов в сочетании с прогнозами связывания повышают вероятность успешного выявления наиболее перспективных кандидатов-неопептидов. И действительно: применение данного комплекса в лечении пациентов с меланомой и другими онкологическими заболеваниями осуществимо и целесообразно.

Несмотря на высказанные предположения о том, что рекуррентные драйверные неоантигены можно подвергнуть иммунному редактированию, и открытие всего лишь нескольких рекуррентных неоантигенов к данному моменту, информация, полученная по результатам нашего анализа, подкрепляет представление о том, что эти антигены могут оказаться более многочисленными, чем предполагалось ранее. Так как пластичность подтвержденных пар HLA-неоантигенов, полученных из частых рекуррентных мутаций вместе с парными T-клеточными рецепторами, может по умолчанию служить стандартной мишенью для иммунотерапии, релевантной для многих пациентов, систематическое применение нашего подхода имеет большое значение для персонализированной медицины.

Другие актуальные исследования:

Дата публикации: 22.10.2021