Конструирование кастомизируемой антибактериальной платформы на базе T6SS в Vibrio natriegens

Новая альтернатива антибиотикам от израильских ученых

Учёные из Тель-Авивского университета разработали новую технологию, которая позволит вводить в организм «хорошие» бактерии путем введения токсинов, устраняя таким образом «плохую» микрофлору, устойчивую к антибиотикам. Исследователи считают, что это может стать перспективной заменой антибиотиков, эффективность которых в последнее время снижается.

Авторы исследования: Жанна Бисванат, Кинга Кеппель, Дор Саломон (департамент клинической микробиологии и иммунологии, Тель-Авивский университет).

Введение

В связи с быстрым распространением бактерий и инфекций, резистентных к множественным препаратам, и дефицитом новых эффективных антибиотиков мы быстро приближаемся к «пост-антибиотической эре», в которой бактериальные инфекции, считающиеся излечимыми, вновь станут опасными для жизни. Эксперты полагают, что неправильное и чрезмерное использование антибиотиков в медицине и животноводстве поспособствовало возникновению штаммов, резистентных к антибиотикам. Более того: по описанию семейства Vibrionaceae видно, что глобальные экологические изменения обеспечили распространение болезнетворных бактерий и появление новых патогенных штаммов.

Необходимо срочно разработать новые стратегии антибактериальной терапии в виде альтернативы антибиотикам, чтобы предотвратить и нейтрализовать растущую угрозу со стороны бактериальных патогенов. К счастью, научное сообщество приняло этот вызов, и в последние годы эксперты разработали несколько подходов к антибактериальной терапии, призванных справиться с этой все более актуальной проблемой. К таким подходам относятся, например:

Фаготерапия;
Бактериоцины;
Оптимизированные токсины;
Экспрессия которых индуцируется после доставки их кодирующей ДНК к патогену-мишени;
Применение методов редактирования генома (включая CRISPR-Cas), позволяющих обратить резистентность бактерий к антибиотикам.

Несмотря на перспективность, каждый из этих подходов имеет собственные ограничения – например, зависимость от конкретных рецепторов, присутствующих на поверхности клетки-мишени; зависимость от механизма активации клетки-мишени, включая транскрипцию и трансляцию; или метод доставки, к которому бактерии могут быстро выработать устойчивость. Таким образом, если мы хотим лидировать в «гонке вооружений» против бактериальных патогенов, нельзя опираться на единственную стратегию антибактериальной терапии.

Бактерии на протяжении миллиардов лет борются друг с другом за ресурсы. За это время они развили эффективные молекулярные инструменты уничтожения своих конкурентов. Многие грамотрицательные бактерии используют контактзависимый аппарат секреции белка – так называемую систему секреции VI типа (T6SS) – для доставки токсичных эффекторных белков в соседние клетки. Несмотря на то, что системы T6SS ранее описывались как механизмы нападения на эукариотические клетки, к данному моменту стало известно, что большинство из них играют определенную роль в межбактериальной конкуренции. Используя грубую силу, системы T6SS доставляют арсенал антибактериальных эффекторов в конкурирующие бактерии другого вида. Эти антибактериальные эффекторы закодированы в оперонах совместно с белками когнатного иммунитета, защищающими от самоинтоксикации и интоксикации родственных бактерий за счет непосредственного связывания с активным центром эффектора и его окклюдирования.

Способность T6SS отравлять бактерии других видов и доставлять комплекс токсичных эффекторов, синергически воздействующих на стабильные, неотъемлемые компоненты бактерий, делает ее перспективным, хоть и малоизученным, инструментом борьбы с бактериальными инфекциями. И действительно: Тинг и соавторы недавно описали конструирование «программируемых ингибиторных клеток», использующих поверхностные нанотела для специфического связывания и интоксикации избранных бактерий в смешанной популяции через активность T6SS. Их доказательная система основывается на конститутивно-активной T6SS условно-патогенного микроорганизма Enterobacter cloacae и на ее природном репертуаре антибактериальных эффекторов.

В представленной работе мы попытались создать инновационный экспериментальный метод биологической терапии с индуцируемыми и кастомизируемыми антибактериальными свойствами. Внедрив T6SS в Vibrio natriegens, мы вооружили эту безопасную, непатогенную бактерию способностью бороться с другими бактериями. Мы модифицировали T6SS таким образом, чтобы она служила индуцируемым оружием. Используя методы клеточной инженерии, мы оборудовали ее переключателем, обеспечивающим экспрессию T6SS только в виде реакции на внешний стимул. Мы также продемонстрировали, что за счет манипулирования эффекторной нагрузкой можно изменить антибактериальную активность и диапазон токсичности данной платформы.

Ход исследования

Штаммы и среды

Vibrio parahaemolyticus и Vibrio natriegens выращивались в среде MLB (лизогенный бульон [LB] с 3% массы/объема NaCl) или в минимальной морской среде (MMM) на агаровых пластинах (1,5% массы/объема агара, 2% массы/объема NaCl, 0,4% массы/объема галактозы, 5 ммоль MgSO4, 7 ммоль K2SO4, 77 ммоль K2HPO4, 35 ммоль KH2PO4 и 2 ммоль NH4Cl) при 30° C. Vibrio alginolyticus выращивались в среде MLB и на агаровых пластинах со средой MLB (1,5% массы/объема) при 30° C. Vibrio vulnificus, Aeromonas jandaei и Salmonella enterica выращивались в среде LB или на агаровых пластинах со средой LB (1,5% массы/объема). V. vulnificus и A. jandaei выращивались при 30° C, в то время как S. enterica выращивались при 37° C.

Когда у V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, A. jandaei или V. natriegens образовывалась плазмида, мы добавляли в среду хлорамфеникол (10 мкм/мл), канамицин (30 мкм/мл) или гентамицин (50 мкм/мл) для сохранения плазмиды. E. coli выращивались в бульоне 2xYT (1,6% массы/объема триптона, 1% массы/объема дрожжевого экстракта и 0,5% массы/объема NaCl) при 37° C. Когда у E. coli образовывалась плазмида, мы добавляли в среду хлорамфеникол (10 мкм/мл), канамицин (30 мкм/мл), эритромицин (250 мкм/мл) или гентамицин (50 мкм/мл) для сохранения плазмиды. Когда от арабиноза-индуцируемого промотора требовалась экспрессия генов, мы, как указано, добавляли в среду 0,1% массы/объема арабинозы-L.

Дрожжи Saccharomyces cerevisiae MaV203 выращивались на дрожжевых синтетических (SD) агаровых пластинах (0,67% массы/объема дрожжевой азотной базы без аминокислот, 0,14% массы/объема добавки для дрожжевой синтетической среды, 2% массы/объема глюкозы, 0,01% массы/объема лейцина, 0,002% массы/объема урацила, 0,002% массы/объема гистидина, 0,002% массы/объема триптофана и 2% массы/объема агара) при 30° C.

Конструирование плазмиды

Чтобы сконструировать pCLTR, мы амплифицировали методом ПЦР конъюгируемый, низкокопийный челночный вектор E. coli-дрожжи-Vibrio, фрагмент, состоящий из генов p15A ori и CmR из pBAD33, и oriT из pUC18T-mini-Tn7T-Tp-dsRedExpress и внедрили их в линеаризованную плазмиду pYES1L (Novagen), используя метод сборки Гибсона.

Для обеспечения арабиноза-индуцируемой экспрессии мы амплифицировали кодирующие последовательности (CDS) vp1391 и vp1407 из геномной ДНК POR1 V. parahaemolyticus и внедрили их в сайт множественного клонирования (MCS) вектора pBAD/Myc-His (Invitrogen) с канамицин-резистентной кассетой (в рамке и вне рамки C-терминальной метки Myc-His) с применением метода сборки Гибсона в целях генерации pVP1391 и pVP1407, соответственно. Конструирование pTfoY описывалось ранее.

В целях обеспечения арабиноза-индуцируемой экспрессии TssB1-sfGFP или модулей эффекторов и иммунитета у V. natriegens мы вначале внедрили эти кассеты в вышеупомянутые pBAD/Myc-His. Модули эффекторов и иммунитета мы амплифицировали из соответствующих кодирующих бактерий. Что касается TssB1-sfGFP, мы амплифицировали tssB1 (vp1402) и sfgfp из геномной ДНК RIMD 2210633 V. parahaemolyticus и sfGFP-N1 (Addgene), соответственно.

Мы внедрили амплифицированные кассеты в сайт множественного клонирования pBAD/Myc-His, используя метод сборки Гибсона таким образом, чтобы 3′ конец находился в рамке C-терминальной метки Myc-His в плазмиде, за исключением Va02265-0 в 12G01 V. alginolyticus. TssB1 и sfGFP мы разделили линкером длиной в шесть аминокислот (AAAGGG). Далее мы амплифицировали кассеты из pBAD/Myc-His (фрагмента протяженностью от промотора Pbad до терминатора rrnT1) и внедрили их в pVSV209, заменив его гены rfp, CmR и gfp с помощью метода сборки Гибсона.

В итоге мы получили плазмиды pPoNe/iVp12-297/B, pTme/i1VpBB22OP, pVPA1263-Vti2VpRIMD, pVa02265-0Va12G01 и pTssB1-sfGFP (общее наименование pEI-x). Чтобы сконструировать плазмиду с двумя модулями эффекторов и иммунитета (pVPA1263-Vti2+Va02265-0), мы амплифицировали вышеуказанную кассету с Va02265-0 из pBAD/Myc-His (участок от промотора Pbad до терминатора rrnT1) и внедрили ее в pVPA1263-Vti2VpRIMD на 3′ конце кассеты VPA1263-Vti2. В качестве контрольной плазмиды для этих векторов, полученных из pVSV209, мы использовали pBJ209-araC – pVSV209, в которой мы заменили область rfp-gfp областью, охватывающей кодирующие последовательности araC вплоть до терминатора rnnT1, из pBAD/Myc-His при помощи метода сборки Гибсона.

Мы сконструировали pT6SS1 и его производные pT6SS1Ind, pT6SS1Ind/∆hcp1, pT6SS1Effectorless и pT6SS1Effectorless/∆hcp1, используя набор GeneArt High-Order Genetic Assembly System (Invitrogen) и следуя указаниям производителя с небольшими модификациями. Вкратце, мы поделили VpT6SS1 (vp1386-vp1420) на фрагменты по 6,5-10 килобаз с частично совпадающими концами (40-150 п.о.), чтобы обеспечить возможность их соединения через гомологичную рекомбинацию в дрожжах. Мы амплифицировали совпадающие фрагменты методом ПЦР отдельно от геномной ДНК V. parahaemolyticus. Далее мы добавили 200 нг каждого ПЦР-фрагмента к 200 нг линеаризованного остова pCLTR после пурификации из агарозного геля с использованием набора Gel/PCR DNA Fragments Extraction (Geneaid), получили осадок из смеси ДНК с помощью натрия ацетата и этанола и дважды промыли его 70%-ным этанолом.

Высушив полученную ДНК на воздухе, мы суспендировали ее в 10 мкл ультрачистой воды, обработанной системой Milli-Q, и смешали с компетентными клетками дрожжей MaV203, входивших в состав набора. Мы поместили трансформированные дрожжи на агаровые SD-пластины без триптофана и инкубировали их 2-3 дня при 30° C. Мы произвели ПЦР колонии в избранных колониях, чтобы идентифицировать положительные дрожжевые колонии, содержащие требуемый конструкт. Мы соскребли положительную дрожжевую колонию с пластины и лизировали ее; лизат впоследствии использовался для электропорации в DH5α (λ pir) E. coli.

Наконец, мы перенесли плазмиду в V. natriegens методом конъюгации. Чтобы сконструировать pT6SS1, мы использовали геномную ДНК POR1 V. parahaemolyticus в качестве образца и линеаризовали остов pCLTR путем ограничения пищеварения с рестриктазой I-SceI. Для получения pT6SS1Ind мы использовали в качестве образца геномную ДНК POR1 ∆vp1407 V. parahaemolyticus; для получения pT6SS1Ind/∆hcp1 – и POR1 ∆vp1407, и POR1 ∆hcp1 V. parahaemolyticus; для получения pT6SS1Effectorless – POR1 ∆vp1407 и POR1 vp1415AAA V. parahaemolyticus; для получения pT6SS1Effectorless/∆hcp1 – POR1 ∆vp1407, POR1 ∆hcp1 и POR1 vp1415AAA V. parahaemolyticus. В целях получения четырех производных pT6SS1 мы амплифицировали линеаризованный остов pCLTR методом ПЦР из pT6SS1 с включением концов VpT6SS1 таким образом, чтобы можно было рекомбинировать более длинные участки идентичности кластерным фрагментам.

Конструирование делеций и мутантных штаммов

Чтобы сконструировать производное POR1 V. parahaemolyticus с мутацией предположительно активного сайта токсина VP1415 (vp1415AAA), мы вначале амплифицировали методом ПЦР участок протяженностью 1,1 килобаз вверх и 1,1 килобаз вниз от мотива AHH (аминокислоты 562–4 в NP_797794.1) и внедрили его в сайт множественного клонирования суицидального вектора pDM4 (генерирующего pDM4:vp1415), используя метод сборки Гибсона. Затем мы использовали сайт-направленный мутагенез для замены кодонов, кодирующих 563–4, аланинами с целью создания pDM4:vp1415AAA.

Мы внедрили pDM4:vp1415AAA в POR1 V. parahaemolyticus путем трехродительского скрещивания и выбрали трансконъюгаты на агаровых пластинах MMM с добавлением хлорамфеникола (10 мкг/мл). Итоговые трансконъюгаты выращивались на агаровых пластинах MMM, содержащих сахарозу (15% массы/объема), с целью контрселекции и потери sacB-содержащего pDM4. Мы подтвердили итоговый штамм V. parahaemolyticus POR1 vp1415AAA путем амплификации и секвенирования соответствующей области генома.

Конструирование внутрирамочных делеций vp1391, vp1407, tfoY (vp1028) и hcp1 (vp1393) в POR1 V. parahaemolyticus, hcp1 (b5c30_rs15290) в 12-297/B V. parahaemolyticus, а также hcp1 (v12g01_01540) и hcp2 (v12g01_07583) в 12G01 V. alginolyticus уже описывалось ранее. Трижды мутантный штамм V. parahaemolyticus POR1 ∆3xRegulators (∆vp1391/∆vp1407/∆tfoY) конструировался с использованием тех же плазмид pDM4, которые применялись при создании мутантов с единственной делецией (pDM4:vp1391, pDM4:vp1407 и pDM4:tfoY). Как указывалось ранее, делеции осуществлялись последовательно.

Чтобы получить внутрирамочную делецию в tfoY (-pn96_08280) V. natriegens, 04.2548 hcp1 (ba740_rs16850) V. parahaemolyticus и DSM 7311 tssB (bn1126_rs13720) A. jandaei, мы клонировали соответствующие участки протяженностью в 1 килобазу сверху и 1 килобазу снизу в сайт множественного клонирования pDM4 с применением расщепления рестриктазы и лигирования. Мы внедрили плазмиды в соответствующие штаммы и осуществили делеции согласно опубликованным указаниям.

Чтобы сконструировать VnatReg, мы вначале клонировали 1 килобазу вверх и 1 килобазу вниз от dns-гена V. natriegens (pn96_00865) в pDM4 с использованием расщепления рестриктазы и лигирования в целях создания pDM4:dnsVnat, в который можно внедрить последовательности, использованные нами в целях замещения dns. Затем мы амплифицировали участки от кодирующих последовательностей araC до терминатора rrnT1 методом ПЦР из плазмид pBAD/Myc-His, в которые мы методом сборки Гибсона внедряли vp1407 или vp1409-7 для создания pVP1407 и pVP1409-7, соответственно.

Амплифицированные участки мы внедрили в pDM4:dnsVnat между областями dns в 1 килобазу вверх и 1 килобазу вниз с использованием расщепления рестриктазы и лигирования для создания pDM4:dnsVnat_vp1407 и pDM4:dnsVnat_vp1409-7, соответственно. Затем мы ввели pDM4:dnsVnat_vp1409-7 в V. natriegens путем трехродительского скрещивания и получили трансконъюгаты, в которых кодирующие последовательности dns заменились кассетой araC+vp1409-7, как описано выше (создание Vnatdns::araC+vp1409-7). Наконец, мы внедрили pDM4:dnsVnat_vp1407 в Vnatdns::araC+vp1409-7 и произвели отбор трансконъюгатов с кассетой araC+vp1407 между участками dns в 1 килобазу вверх и 1 килобазу вниз внутри хромосомы (создание VnatReg).

Анализы бактериальной конкуренции

Бактериальная конкуренция осуществлялась согласно указаниям, представленным ранее. Вкратце, штаммы атакующих клеток и добычи выращивались одну ночь в жидкой среде (MLB при 30° C для V. parahaemolyiticus, V. natriegens и V. alginolyticus; 2xYT при 37° C для E. coli; LB при 30° C для V. vulnificus и A. jandaei и при 37° C для S. enterica) с добавлением антибиотика при необходимости сохранения плазмид. Мы нормализовали культуры до OD600 = 0,5 и смешали в соотношении 4:1 (агрессор:добыча) при использовании единственного штамма добычи.

Для бактериальной конкуренции со смешением 5 различных штаммов добычи соотношение агрессора и добычи составило 10:1:1:1:1:1 (агрессор:E. coli:V. vulnificus:A. jandaei:S. enterica:V. natriegens). Мы вывели трипликаты каждой конкурирующей смеси в средах LB, MLB или MLB на агаровых пластинах с добавлением 0,1% (масса/объем) арабинозы-L (в случае, если требовалась экспрессия промотора Pbad) и инкубировали в течение 4 ч или 24 ч при 20, 28, 30 или 37° C согласно указаниям. Жизнеспособность добычи мы определили по уровням колониеобразующих единиц (КОЕ), зафиксированных в указанное время.

При необходимости штаммы добычи содержали плазмиды, служащие маркером селекции (для V. natriegens: pBAD/Myc-His, pBAD18 или pCLTR; для V. parahaemolyticus, V. alginolyticus и A. jandaei: pBAD18; для E. coli: pBAD18 или pTnp1222). Мы повторяли анализы от двух до трех раз, получая схожие показатели; ниже представлены результаты репрезентативного эксперимента.

Анализ экспрессии и секреции VgrG1

Экспрессия и секреция VgrG1, отличительного секретируемого белка VpT6SS1, определялась по ранее опубликованным указаниям с небольшими модификациями. Указанные штаммы V. parahaemolyticus и V. natriegens выращивались одну ночь в среде MLB с добавлением соответствующих антибиотиков для сохранения плазмид. Мы нормализовали культуры до OD600 = 0,18 в той же среде и согласно указаниям добавили арабинозу-L (0,1% массы/объема), чтобы индуцировать экспрессию промоторов Pbad.

Мы добавили 20 мкг Фенамила (ингибитора полярных жгутиков, используемых для мимикрии активации поверхностного распознавания) в целях индукции T6SS1, согласно указаниям. Нормализованные культуры выращивались в течение 5 ч (для V. parahaemolyticus) или 3,5 ч (для V. natriegens, если не указано иное) при 30° C или 28° C согласно указаниям, при постоянным взбалтывании.

Чтобы оценить экспрессию VgrG1 (клетки), мы собрали осадок из 1,0 OD600 единиц и ресуспендировали клетки в буфере 2x Tris-glycine SDS (Novex, Life Sciences). Для секретируемых фракций мы собрали осадок из 10 OD600 единиц и отфильтровали супернатанты (0,22 мкг). Преципитат белка из супернатантов мы получили с помощью дезоксихолата натрия и трихлоруксусной кислоты. Мы дважды промыли преципитат белка холодным ацетоном и высушили на воздухе. Наконец, мы ресуспендировали преципитаты в 20 мкг из 150 ммоль Tris-Cl (pH = 8,0), после чего добавили 20 мкг буфера 2x Tris-glycine SDS (Novex, Life Sciences). Образцы экспрессии и секреции инкубировались при 95° C в течение 10 мин., после чего мы расщепили их гелем TGX, свободным от штаммов (Bio-Rad).

Затем мы перенесли белки на нитроцеллюлозные мембраны, используя Trans-Blot Turbo Transfer (Bio-Rad) и произвели иммуноблоттинг мембран специально сгенерированными анти-VgrG1 антителами в виде раствора 1:1000. Мы визуализировали загрузку белковых лизатов через анализ флуоресценции составов в мембранах после иммуноблоттинга. Белковые сигналы визуализировались с помощью субстрата с усиленной хемилюминесценцией (ECL). Мы повторили эксперименты от двух до трех раз и получили схожие показатели. Ниже представлены результаты репрезентативного эксперимента.

Количественная ОТ-ПЦР

Изоляты Vibrio parahaemolyticus выращивались одну ночь в среде MLB с добавлением антибиотиков при необходимости сохранить плазмиды. Мы нормализовали эти культуры до OD600 = 0,18 в 5 мл MLB и затем выращивали при 30° C в течение 2 ч. Мы добавили Фенамил (20 мкмоль), чтобы индуцировать экспрессию генов VpT6SS1. При необходимости мы добавляли в среду 0,1% (масса/объем) арабинозы-L для экспрессии плазмида-кодируемых генов, регулируемых промоторами Pbad.

Мы отобрали клетки, эквивалентные 1,0 OD600 единицам и промыли их реагентом RNAprotect Bacteria Reagent (Qiagen). Затем мы изолировали РНК из осадка бактерий с помощью Bacterial RNA kit (Biomiga), следуя инструкции производителя. Мы синтезировали комплементарную ДНК (кДНК) из изолированной РНК (1 мкг) с помощью SuperScript III First-Strand Synthesis System для набора ОТ-ПЦР (Invitrogen), следуя инструкции производителя.

Для синтеза комплементарной ДНК мы использовали смесь случайных гексамеров и праймеров (Invitrogen). В целях проведения ОТ-ПЦР мы смешали 2 нг матричной кДНК (в трипликате) с прямым и обратным праймерами (по 300 нмоль каждого) и с 2x Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems). Мы произвели ОТ-ПЦР и анализ, используя инструмент и программное обеспечение QuantStudio 12K Flex (Applied Biosystems). Мы использовали 16s рРНК в качестве эндогенного контроля и проанализировали дифференциальную экспрессию генов, указанную как кратность изменения, методом 2-∆∆Ct. Наборы праймеров разрабатывались при помощи сервера Primer3web для амплификации репрезентативного гена из каждого кластерного оперона VpT6SS1 (например, vp1386, vp1388, vp1392, vp1393, vp1406, vp1409 и vp1414).

Анализы роста бактерий

Мы нормализовали культуры V. natriegens, выращенные за одну ночь, до 0,01 OD600 в среде MLB и перенесли их на 96-луночные планшеты (200 мкл на лунку; n = 4). Культуры мы выращивали при указанных температурах в микропланшетном ридере BioTek SYNERGY H1 с постоянным взбалтыванием при 205 см/мин. Показатели OD600 снимались каждые 10 мин.

Сборка оболочки T6SS

Мы внедрили pTssB1-sfGFP, плазмиду для арабиноза-индуцируемой экспрессии белка TssB1 (VP1402) оболочки VpT6SS1, гибридизированного в sfGFP, в штаммы VnatReg, являющиеся носителями pT6SS1effectorless или pT6SS1effectorless/∆hcp1, методом конъюгации. Мы выращивали бактерии одну ночь в среде MLB с добавлением соответствующих антибиотиков для сохранения плазмид, после чего нормализовали культуры до OD600 = 0,18 в среде MLB с добавлением антибиотиков и 0,1% (масса/объем) арабинозы-L. Мы выращивали нормализованные культуры в течение 3 ч при 28° C, после чего собрали по 100 мкл каждой культуры и дважды промыли средой M9.

Далее мы ресуспендировали клетки в 100 мкл среды M9 и нанесли 1 мкл бактериальных суспензий на MLB-агарозные (1,5% массы/объема) подкладки с добавлением 0,1% (масса/объем) арабинозы-L. Мы оставили подкладки сушиться на 5 мин., после чего уложили их лицевой стороной вниз в 35-миллиметровые чашки для культивирования клеток Cellview со стеклянным дном.

Мы изучали бактерии через инвертированный моторизованный микроскоп Nikon Eclipse Ti2-E, оснащенный апохроматом CFI PLAN, линзой DM 100X oil lambda PH-3 (NA, 1.45), источником света Lumencor SOLA SE II 395 и наборами фильтров ET-EGFP (#49002, используемый при визуализации сигнала GFP). Для получения изображений мы использовали охлаждаемую цифровую камеру микроскопа (16MP) DS-QI2 Mono. Для постобработки изображений применялся пакет Fiji ImageJ.

Статистический анализ

Мы анализировали данные с помощью GraphPad Prism 9 и Microsoft Excel, используя двухвыборочный t-критерий Стьюдента для независимых выборок, если не указано иное. Разница в P < 0,05 считалась значительной.

Результаты

В данной работе представлена экспериментальная, клеточно-инженерная модульная бактериальная платформа для контролируемой доставки антибактериальных эффекторов через T6SS. Мы полагаем, что такая платформа может служить основой для персонализированных, синтетических биологических препаратов против бактериальных патогенов. Одно из главных преимуществ платформы заключается в ее адаптируемости: ее можно модифицировать для реакции на внешний стимул с помощью регулируемого переключателя. Можно манипулировать и арсеналом ее эффекторных белков.

Более того: важной характеристикой данной платформы является ее модульность. T6SS-кодирующий генный кластер, лишенный эффекторов и неактивный сам по себе (в нем отсутствует vp1407), отделен от переключателя и модулей эффекторов и иммунитета, обеспечиваемых in trans. Эта модульность упрощает будущие действия, направленные на кастомизацию регулирования платформы, ее репертуара эффекторов и – соответственно – потенциального диапазона интоксикации.

Кроме того, модульная разработка учитывает необходимость предотвратить дальнейшее перенятие этой клеточно-инженерной системы другими бактериями после ее выпуска в качестве средства биологической терапии; физическое разделение компонентов должно препятствовать приобретению полной и функциональной системы конкурирующими бактериями через горизонтальный перенос генов.

Мы полагаем, что данную платформу можно использовать в качестве специфического, патоген-ориентированного средства биологической терапии после дальнейшей кастомизации с учетом следующих предложений: (i) Переключатель необходимо индуцировать по обнаружении патогена-мишени или релевантной ниши, предупреждая таким образом бесцельную активацию энергозатратного аппарата. Этого можно добиться, например, через апроприацию механизма регуляции чувства кворума у патогена-мишени с целью стимуляции экспрессии переключателя платформы; (ii) платформа должна отравлять только желаемые патогены и оставаться доброкачественной по отношению к остальным бактериям в целях профилактики нежелательного дисбиоза. Этого можно достигнуть за счет оснащения ее эффекторами с естественной или синтетической мишень-специфической токсичностью.

Специфичности можно добиться и альтернативным методом, то есть за счет интеграции данной платформы с адгезия-опосредованными таргетными механизмами. Тинг и соавторы недавно описали такой метод, подразумевающий селективное направление бактерии с антибактериальными свойствами к интересующему патогену внутри смешанной популяции через поверхностные нанотела, опосредующие специфическую клеточную адгезию. Вероятно, интеграция обеих технологий позволит использовать нашу платформу в качестве средства антибактериальной терапии в жидкой среде; (iii) модули эффекторов и иммунитета, внедряемые в платформу, должны напрямую регулироваться переключателем T6SS.

В таком случае будущая кастомизация потребует замены только одного модуля регулирования (например, модуля переключателя). Этого можно добиться через контроль модулей промотором из оперона VpT6SS1, напрямую регулируемого VP1407; (iv) готовое средство биологической терапии должно быть безопасным. В представленной работе платформу населяют V. natriegens, считающиеся безопасными, непатогенными бактериями. Тем не менее, перед внедрением платформы в клиническую практику даже такие бактерии должны пройти модификацию, ограничивающую их способность приобретать внешнюю генетическую информацию, в которой могут содержаться факторы вирулентности, – например, через нарушение механизмов их естественной компетентности; (v) готовая платформа должная быть стабильной.

Примечательно, что в текущем экспериментальном состоянии платформы отдельные ее части находятся на плазмидах. В будущих готовых версиях все модули должны быть внедрены в бактериальную хромосому в целях обеспечения их долгосрочной стабильности.

Текущий хозяин платформы, V. natriegens, способен выживать и расти в разных условиях. Так как это естественный обитатель морской среды, мы прогнозируем, что он может служить средством биологической терапии в условиях морской аквакультуры. С этой целью мы продемонстрировали, что платформа функционирует в условиях, подходящих для рыбоводства, и что она активна против различных морских патогенов. Примечательно, что предварительные конкурентные анализы дали такие соотношения эффектор-мишень, в которых наиболее благоприятную позицию занимает эффектор.

Несмотря на неточность воспроизведения условий конкуренции в окружающей среде, нужно отметить, что мы использовали экспериментальную платформу, которая еще не оснащена репертуаром наиболее действенных эффекторов против интересующего патогена. Мы прогнозируем, что эту или схожие платформы можно интегрировать в различных бактериальных хозяев, обитающих в разных средах, и тем самым создать синтетические средства биологической терапии на базе T6SS, которые можно будет использовать в различных экологических и клинических условиях.

В дополнение к ее возможной применимости в качестве средства биологической терапии платформа без эффекторов также служит ценным исследовательским инструментом, способным дать ответы на базовые вопросы в области T6SS. Например, благодаря возможности внедрения одиночных эффекторов в платформу без эффекторов антибактериальный эффект атакующего штамма будет опосредован только одним эффектором. Таким образом, эффектор можно исследовать в естественных условиях, в которых он доставляется в различные клетки-мишени через T6SS, вместо экзогенной сверхэкспрессии внутри суррогатной клетки.

Более того: доставка одиночных эффекторов позволяет проанализировать те факторы мишени, которые отвечают за чувствительность или резистентность. Так, мы обнаружили, что эффекторы способны отравлять определенные бактериальные мишени, не воздействуя при этом на другие бактерии. Несмотря на то, что данный феномен может обеспечить нашу платформу узким диапазоном воздействия на специфические бактериальные патогены, он также подчеркивает тот факт, что естественная T6SS использует различные арсеналы эффекторов для обеспечения интоксикации разных бактерий-конкурентов.

Тем не менее, все еще неизвестно, за счет чего обеспечивается отсутствие токсичности по отношению к определенным бактериям: за счет характеристик действия эффектора, за счет способности T6SS доставлять эффектор в конкретные клетки-мишени, за счет экологических условий, в которых протекает конкуренция, или за счет свойства добычи, обеспечивающего ее резистентность к воздействию определенных эффекторов. Примечательно, что естественная резистентность бактерий к интоксикации эффекторами T6SS, не опосредованная белками когнатного иммунитета, недавно упоминалась в других исследованиях. Таким образом, наша платформа служит уникальным инструментом, обеспечивающим T6SS-опосредованную секрецию одиночных эффекторов в широком диапазоне экологических условий и позволяющим изучать диапазоны токсичности эффекторов, а также механизмы и стратегии естественной резистентности.

Данную платформу также можно использовать в целях изучения эффекторной синергии – понятия, недавно предложенного ЛаКурсом и соавторами. Она позволяет выборочно внедрять множественные эффекторы и конкурировать с различными штаммами-мишенями в разнообразных средах. Данные, которые можно получить по результатам таких анализов, совместно с вышеупомянутой мишень-специфичностью эффекторов, можно использовать при конструировании репертуара патоген-ориентированных эффекторов в рамках разработки готовых средств биологической терапии.

В заключение, в данной работе мы описываем конструирование бактериальной платформы, которую можно применять в разработке методов антибактериальной биологической терапии. После дальнейшей адаптации ее активационных стимулов и оптимизации эффекторного репертуара в целях обеспечения возможности специфического распознавания и воздействия на бактериальный патоген-мишень эффективность данной платформы и ее способность защищать от бактериальных инфекций будет тестироваться in vivo.

Мы также надеемся, что методы и инструменты, представленные в данной работе, послужат ориентиром для других исследователей, заинтересованных в изучении эффекторов и действия бактериальных систем секреции. Эти инструменты будут особенно полезны тем, кто интересуется системами секреции бактерий, с трудом поддающихся культивированию или генетическим манипуляциям либо имеющим другие системы секреции, маскирующие функцию нужных систем.

Другие актуальные исследования:

Дата публикации: 28.09.2021