Ихилов Израиль Ichilov
Топ Ихилов
Официальный сайт
Израиль, Тель-Авив, ул. Вайцман 14
Тель-Авив: +972-3-7621629 Москва: +7-495-7773802 Прошу перезвонить

Позвонить в Топ Ихилов

Новые данные о воздействии вируса SARS-CoV-2 на почки от израильских исследователей

Новые данные о влияниии коронавируса на почки.

Исследователи из МЦ Шиба и Института биологии в Нес-Ционе провели уникальное исследование, посвящённое влиянию коронавируса на функцию почек. Его результаты недавно были опубликованы в престижном журнале американского общества нефрологов.

Авторы исследования: Дорит Омер (МЦ Шиба, Тель-Авивский университет), Орен Пленицеану (МЦ Шиба), Иехуда Гнатек (МЦ Шиба, Тель-Авивский университет), Михаил Наместников (МЦ Шиба, Тель-Авивский университет), Оснат Коэн-Зонтаг (МЦ Шиба, Тель-Авивский университет), Санья Гольдберг (МЦ Шиба, Тель-Авивский университет), Юдит Эден Фридман (МЦ Шиба), Немея Фридман (МЦ Шиба), Михал Мандельбоим (МЦ Шиба), Эйнат Витнер (Израильский Институт биологии), Хагит Ашдот (Израильский Институт биологии), Рой Авраам (Израильские Институт биологии), Эран Захави (Израильский Институт биологии), Томер Израэли (Израильский Институт биологии), Хаим Майан (Тель-Авивский университет, МЦ Шиба), Бенджамин Декель (МЦ Шиба, Тель-Авивский университет).

Введение

Недавняя пандемия коронавируса, связанного с тяжелым острым респираторным синдромом (SARS-CoV-2) и вызывающего коронавирусную инфекцию 2019 года (COVID-19), по данным на 18 июля 2020 г. привела к заражению свыше 110 миллионов человек и смерти более, чем 2 500 000 человек по всему миру. Несмотря на то, что основные проявления инфекции – легочные (например, пневмония и острый респираторный дистресс-синдром [ОРДС]), она поражает и другие органы, из которых наибольшей клинической значимостью обладают почки. Спектр поражения почек при COVID-19 широк и включает острое почечное повреждение (ОПП), гематурию, протеинурию и метаболический ацидоз.

В настоящее время все еще ведутся дискуссии по поводу частоты и механизма поражения почек при COVID-19. В частности, неизвестно, как развивается заболевание почек, связанное с SARS-CoV-2: в результате непосредственной инфекции почек или под воздействием опосредованных механизмов. К последним потенциально относятся эндотелиальная дисфункция с микрососудистыми повреждениями, цитокиновый шторм и другие неспецифические этиологические факторы, наблюдающиеся у тяжело больных пациентов, нуждающихся в искусственной вентиляции легких (например, гипертензия и сепсис). И действительно: и клинические, и молекулярные исследования повреждений почек в связи с COVID-19 дали чрезвычайно противоречивые результаты. В том, что касается клинической картины, ранние исследования в Китае указали на низкую частоту ОПП (0,5-15%) у госпитализированных пациентов, в то время как по итогам более поздних исследований в США обнаружились гораздо более высокие показатели в 37-57%.

Не менее противоречивые результаты дали и попытки объяснить механизмы поражения почек при COVID-19. В поддержку гипотезы о прямом повреждении почек несколько групп выявили потенциальные вирусные частицы внутри почечных канальцев методом электронной микроскопии (ЭМ) и получили положительные результаты иммунного окрашивания на вирус. Совсем недавно SARS-CoV-2 изолировали из почки, полученной по результатам вскрытия. Исследователи продемонстрировали, что вирус инфицирует нечеловеческие почечные клетки и продолжает репликацию. Более того: hACE2, рецептор SARS-CoV-2, активно экспрессируется клетками почечных канальцев, что указывает на потенциальный почечный тропизм. И напротив, другие группы доказали, что антитело, применявшееся для выявления вируса, имело неспецифический характер, и подвергли под сомнение природу частиц, обнаруженных методом ЭМ, так как они также могут оказаться неспецифическими. Аналогичным образом, несколько групп либо не смогли обнаружить вирусную РНК в моче, либо обнаружили ее лишь у небольшого числа пациентов. Соответственно, неизвестно, способен ли SARS-CoV-2 инфицировать клетки почек и размножаться в них. Более того: само по себе присутствие вируса в клетках почек не равняется повреждению почек, которое еще сложнее изучать на примере пациентов.

Основное препятствие к получению ответов на эти ключевые вопросы состоит в отсутствии такой модели человеческого заболевания, которая воспроизводила бы инфекционный процесс с использованием человеческих почечных клеток и позволяла бы изучить действие вируса на почки непосредственно и проспективно. Ранее мы разработали 3D-платформу человеческих клеток почечного эпителия на основе культуры in vitro и назвали ее почечными сфероидами (kSPH). Эта модель поддерживает идентичность медленно пролиферирующих клеток почечного эпителия, соответствующую нативной почке взрослого человека в плане экспрессии генов и поверхностных маркеров.

В рамках представленной работы мы запросили клинические данные первых 36 тяжелобольных пациентов с COVID-19, последовательно поступивших в медицинский центр «Шиба», и выяснили, что у всех пациентов с ОПП помимо инфекции имелось сопутствующее заболевание, потенциально способное повлечь развитие ОПП. После этого мы приступили к анализу почечных сфероидов и монослоев, инфицированных SARS-CoV-2 и являющихся надежными моделями для изучения отношений между хозяином и патогеном при HCoV229E и SARS-CoV-2. Важно отметить, что в почечных клетках взрослого человека отмечаются заведомо повышенные уровни молекул интерферона 1 типа в сравнении с клетками почечного эпителия Vero E6, потенциально способными обеспечить относительную защиту.

Далее мы демонстрируем, что, несмотря на отсутствие цитопатического эффекта/клеточной смерти в культурах человеческих почечных клеток, пролиферирующие культуры более уязвимы перед инфекцией и отличаются ап-регуляцией молекулярных маркеров, указывающих на повреждения почечных канальцев. Полученные данные свидетельствуют о том, что клетки почечного эпителия Vero E6 не могут служить надежной моделью взаимодействия между почками и вирусом SARS-CoV-2. Таким образом, по поведению клеток ex vivo можно прогнозировать специфическую уязвимость клеток почечных канальцев перед SARS-CoV-2 после клеточной пролиферации, вызванной острым тубулярным некрозом (ОТН).

Ход исследования

Используя клеточные модели ex vivo, мы попытались проанализировать взаимодействие SARS-CoV-2 с тубулярными клетками почек и оценить степень непосредственного повреждения почечных канальцев. Модели состояли из первичных человеческих клеток почечного эпителия (извлеченных в ходе нефрэктомии и выращенных в виде пролиферирующей культуры в состоянии монослоя) и более латентных трехмерных почечных сфероидов.

Почечные сфероиды экспрессируют SARS-CoV-2-рецепторы hACE2, TMPRSS2 и CD147

Чтобы изучить взаимодействие между вирусом SARS-CoV-2 и человеческой почкой, мы решили оценить воздействие инфекции SARS-CoV-2 на модель человеческой почки in vitro. В этих целях мы решили использовать почечные сфероиды, так как известно, что они воспроизводят эпителиальные фенотипы и функцию человеческих почек. Для того, чтобы определить, могут ли сфероиды служить моделью для изучения взаимодействия хозяин-патоген на примере человеческой почки и SARS-CoV-2, мы проверили, экспрессируют ли они поверхностные маркеры, считающиеся рецепторами SARS-CoV-2, а именно hACE2, TMPRSS2 и CD147. Примечательно, что по результатам секвенирования РНК почечные сфероиды экспрессировали значительно более высокие уровни АПФ2 и BSG и приблизительно те же уровни TMPRSS2, что и первичные человеческие 2D-клетки почечного эпителия (hKEpCs).

Результаты иммуногистохимического окрашивания почечных клеток плода и взрослого человека подтвердили, что на белковом уровне в почечных канальцах происходит частая и широко распространенная экспрессия АПФ2, CD147 и TMPRSS2, сравнимая с их экспрессией в легочной ткани. Примечательно, что белки, как уже было указано, находились в почечных канальцах и отсутствовали в клубочках. В почечных сфероидах наблюдалась стойкая экспрессия АПФ2, CD147 и TMPRSS2 на белковом уровне, подтверждающая схожесть культур с тканями нативной почки взрослого человека. При этом экспрессия не зависела от того, кем являлся донор: здоровым человеком или пациентом с хронической почечной недостаточностью (ХПН).

Примечательно, что в сфероидах, выращенных из почечных клеток плода, отмечалась более низкая экспрессия АПФ2. И наконец, мы ввели почечные сфероиды подкожно мышам NOD-SCID, сгенерировав таким образом человеческие тубулярные структуры. По результатам окрашивания тубулярных структур на маркеры проксимальных канальцев LTL и АПФ2 выяснилось, что проксимальные канальцы экспрессируют АПФ2 в соответствии с выводами, сделанными по итогам наблюдений in vitro. В совокупности эти результаты демонстрируют, что почечные сфероиды схожи с нативной почкой в отношении экспрессии рецепторов к SARS-CoV-2.

SARS-CoV-2 инфицирует почечные сфероиды и монослои

Впоследствии мы попытались установить прямую связь между инфекцией SARS-CoV-2 и поражением почек при COVID-19. В этих целях мы проверили, способен ли SARS-CoV-2 инфицировать первичные клетки человеческой почки и почечные сфероиды – и обладает ли инфекция цитопатическим эффектом. Изначально в целях проверки концепции мы установили, может ли HCoV-229E – другой штамм коронавируса и частая причина вирусных инфекций верхних дыхательных путей – инфицировать человеческие клетки почечного эпителия и почечные сфероиды.

Транскриптомные данные указали на стойкую экспрессию HCoV-229E-рецептора CD13 (ANPEP) и в человеческих клетках почечного эпителия, и в почечных сфероидах, что подтвердилось на белковом уровне по итогам иммунофлуоресцентного окрашивания тканей почки взрослого человека, hKEpC, kSPH и тубулярных структур in vivo, выращенных из kSPH. Затем мы инкубировали hKEpC и kSPH с HCoV-229E на 48 часов и оценили уровень инфекции по числу копий вируса в питательной среде с первичным переносом клеток человеческого легкого, служивших группой положительного контроля. По результатам количественной ПЦР обнаружились высокие уровни вирусной нагрузки в клетках всех типов, причем уровни инфекции в hKEpC и kSPH оказались сопоставимы с клетками человеческого легкого.

Доказав, что hKEpC и kSPH облегчают заражение HCoV-229E, мы попытались инфицировать обе культуры вирусом SARS-CoV-2, измеряя уровень инфекции общим количеством эквивалентов бляшкообразующих единиц (БОЕ) в питательной среде и в клетках по результатам кПЦР спустя 48 часов после заражения. Примечательно, что и в hKEpC, и в kSPH отмечалось существенное повышение уровней вирусной РНК – причем как в клетках, так и в питательной среде. В дополнение мы измерили уровни вирусной нагрузки в субстратах hKEpC, kSPH и клеток Vero E6, сравнив общее количество БОЕ в неинфицированных и инфицированных клетках в день 0 и день 1. Мы обнаружили, что через 24 часа уровни вирусной нагрузки существенно повышаются в клетках всех типов.

Примечательно, что эти уровни инфекции либо повторяют (почечные сфероиды), либо превышают (человеческие клетки почечного эпителия) те параметры, которые приводят к функциональным цитопатическим эффектам в клетках других типов. Затем мы протестировали субгеномную РНК для того, чтобы подтвердить репликацию вируса. В инфицированной группе обнаружились высокие уровни вирусной субгеномной РНК, что подтверждает вирусную инфекцию в hKEpC и kSPH. Для того, чтобы выявить SARS-CoV-2 методом иммунного окрашивания, мы использовали гипериммунную кроличью сыворотку от кролика, зараженного SARS-CoV-2 через внутривенную инъекцию. Мы установили наличие вируса в hKEpC и kSPH, а также в клетках Vero E6, служивших группой положительного контроля.

SARS-CoV-2 не вызывает цитопатического эффекта, но может привести к изменениям в молекулах повреждения почек

Несмотря на то, что инфекция SARS-CoV-2 вызвала явный цитопатический эффект в клетках Vero E6, в hKEpC и kSPH по результатам световой микроскопии не обнаружилось никаких распознаваемых морфологических изменений – даже после инфицирования очень высокими титрами (множественность инфекции 4-8). Данное явление наблюдалось и при более длительном инфицировании клеток (в течение 72 часов) с последующей проверкой их жизнеспособности. По этим результатам видно, что даже несмотря на значительное снижение жизнеспособности инфицированных клеток Vero E6, жизнеспособность клеток в hKEpC и kSPH после заражения не меняется. Важно также отметить, что несмотря на происхождение клеток Vero E6 из обезьяньей почки, экспрессия различных специфических почечных маркеров несущественна в сравнении с нативной человеческой почкой, что свидетельствует о недостаточной схожести этих клеток с первичными клетками человеческой почки. Кроме того, мы наблюдали ап-регуляцию IRF7, USP18 и CCL5 – генов, активирующихся при вирусной инфекции (в особенности в человеческих клетках почечного эпителия).

Впоследствии с тем, чтобы проверить, очевиден ли разрушительный эффект на молекулярном уровне, мы протестировали, как инфекция влияет на экспрессию генов, связанных с повреждением почечных канальцев. Соответственно, мы исследовали методом кПЦР гены, связанные с фиброзом, и гены, участвующие в реакции почечных канальцев на повреждения, включая дедифференциацию и эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП). В почечных сфероидах существенных изменений не обнаружилось, что указывает на отсутствие молекулярных повреждений в результате инфекции при условии стабильного состояния латентных kSPH.

Так как COVID-19 часто приводит к ОПП, при котором клетки почек переходят в состояние пролиферации, мы проверили, обнаруживаются ли молекулярные признаки повреждения в двухмерных hKEpC, отличающихся большей пролиферативностью и потому более схожих с поврежденной почкой. И действительно: мы выявили повышение уровней экспрессии нескольких генов, связанных с фиброзом (STAT6 и COL1A1), а также гена SNAI2, потенциально указывающего на ЭМП и повреждения почечных канальцев. Далее мы выявили даун-регуляцию маркера проксимальных канальцев LRP2, подразумевающую временную потерю эпителиальной идентичности (т.е., дедифференциацию), характерную для ОПП. В совокупности эти результаты указывают на отсутствие клеточных повреждений даже несмотря на то, что в стабильном состоянии почка легко поддается инфицированию и не препятствует репликации вируса. И напротив: при более пролиферативном состоянии почки, характерном в том числе для ОПП, репликация вируса повышается, и возникают признаки повреждения органа на молекулярном уровне.

Инфекция SARS-CoV-2 приводит к активации сигнального пути интерферона 1 типа в клетках человеческой почки

В дальнейшем нас интересовало изучение молекулярных механизмов, обеспечивающих клетки человеческой почки устойчивостью к цитопатическим повреждениям, связанным с SARS-CoV-2. Судя по недавним докладам, ответ интерферона 1 типа играет определяющую роль в иммунном ответе пациентов с COVID-19, поэтому мы сравнили активность этого сигнального пути в клетках человеческой почки (hKEpC и kSPH) и клетках Vero E6, в которых наблюдаются значительные цитопатические эффекты под воздействием инфекции SARS-CoV-2.

Интересным представляется тот факт, что мы обнаружили более явную активацию множественных генов, ассоциированных с активацией ответа интерферона 1 типа, в hKEpC и kSPH по сравнению с клетками Vero E6. В число таких генов вошли IRF7, IRF8 и STAT2.

Клинические данные не поддерживают важность первичного повреждения почки при COVID-19-индуцированном ОПП

Для того, чтобы проверить, как результаты наших наблюдений in vitro соотносятся с клиническими данными, мы проанализировали когорту из 36 пациентов, представляющую всех пациентов с COVID-19, принятых в отделение реанимации для больных COVID-19 в нашем учреждении в период с марта по июнь 2020. Средний возраст когорты составил 60,9±14,9 лет с преобладанием пациентов мужского пола (83,3%). Все пациенты нуждались в искусственной вентиляции легких, и 47,3% умерли в больнице. У 61,1% больных (22 из 36) в период стационарного лечения (в среднем за 4 дня) обнаружилось ОПП, причем у 36,4% (8 из 22) ОПП диагностировали перед госпитализацией, в то время как у 65,6% (14 из 22) ОПП развилось во время нахождения в стационаре.

В попытке дифференцировать ОПП как следствие прямого вирусного поражения и ОПП как следствие вторичных факторов мы запросили данные о возможных причинах ОПП, не связанных с инфекцией COVID-19. Перед развитием ОПП у пациентов наблюдались такие явления, как хроническая гипотензия, дефицит объема внеклеточной жидкости, шок (септический (не связанный с COVID-19), кардиогенный, обструктивный, геморрагический шок), воздействие нефротоксических препаратов, рабдомиолиз и постренальная обструкция. Примечательно, что у всех пациентов с ОПП при поступлении в больницу (8 из 8) в течение нескольких дней до госпитализации наблюдалась гиповолемия и обезвоживание.

Аналогичным образом, большинство пациентов из группы ОПП отметили, что ухудшению функции почек предшествовала гипотензия (86,4%, 19 из 22 пациентов). У 27,3% пациентов с ОПП (6 из 22) патология почек развилась в первые несколько часов интубации. Более того: у 40,1% (9 из 22) перед ОПП диагностировали сепсис, а у 27,3% (6 из 22) – сердечно-сосудистый коллапс. В совокупности в нашей когорте тяжелобольных пациентов с COVID-19 развитию ОПП неизменно предшествовал явный этиологический фактор помимо инфекции COVID-19. В сумме эти данные указывают на то, что непосредственное заражение вирусом не являлось причиной ОПП у указанных пациентов. Полученные выводы соответствуют предыдущим докладам и результатам исследования in vitro, хотя мы отмечаем, что размер когорты слишком мал и что установление причины ОПП носит слишком субъективный характер для того, чтобы сделать однозначные выводы.

Мы продемонстрировали, что в монослоях и почечных сфероидах присутствовали молекулы, зараженные вирусом. Кроме того, в них наблюдались высокие исходные уровни молекул, связанных с интерфероном 1 типа. Несмотря на то, что обе модели поддерживают инфицирование и репликацию вируса, в них не наблюдается цитопатического эффекта и клеточной смерти – явлений, характерных для контрольных моделей, зараженных SARS-CoV-2 (культуры Vero E6).

В результате сравнения монослойных и сфероидных культур мы обнаружили более высокую инфекционность и репликацию SARS-CoV-2 в активно пролиферирующих монослоях, хотя в сфероидных культурах отмечались более высокие уровни АПФ2. В монослоях также повысились уровни некоторых молекул, указывающих на повреждение почечных канальцев, – включая молекулы, ассоциированные с фиброзом (COL1A1 и STAT6) и дедифференциацией (SNAI2), – и произошла потеря клеточной идентичности, о которой можно судить по снижению уровней мегалина (LRP2). Трехмерные сфероиды оказались менее подвержены таким повреждениям.

SARS-CoV-2 способен инфицировать клетки почек без цитопатического эффекта. Клеточная пролиферация, вызванная ОПП, потенциально может повысить инфекционность и усугубить повреждения почечных канальцев вирусом SARS-CoV-2, что свидетельствует о необходимости раннего вмешательства при ОПП с целью уменьшения инфекционного поражения почек.

Выводы

Несмотря на то, что отличительной чертой текущей пандемии COVID-19 является поражение легких, известно, что инфекция поражает и другие органы и системы. ОПП, которое по итогам двух недавних мета-анализов обнаруживается у 8-9% пациентов, является одним из наиболее загадочных аспектов COVID-19 – в том числе потому, что механизм повреждения остается неустановленным.

Одним из основных препятствий на пути к расшифровке глубинных механизмов поражения почек при COVID-19 является потребность в надежной клеточной модели, которая позволила бы непосредственно оценить воздействие инфекции на клетки почки взрослого человека. Примечательно, что во многих исследованиях использовались различные клеточные линии – как нечеловеческие, так и нечеловеческие, – давшие противоречивые результаты. Например, несмотря на то, что инфицирование обезьяньих клеточных линий Vero и Vero E6 привело к цитопатическому эффекту, клеточные линии собаки (MDCK) и человека (293) в этом отношении не пострадали. Кроме того, недавнее исследование, посвященное извлечению SARS-CoV-2 из почки, полученной после вскрытия, основывалось на использовании клеток приматов, а не человека, при тестировании репликационной способности вируса.

Важно отметить, что и монослои hKEpC, и трехмерные почечные сфероиды поддерживают внедрение и репликацию SARS-CoV-2. Тем не менее, это не приводит ни к цитопатическому эффекту, ни к глубокому повреждению клеток, явственно наблюдающемуся в клеточной линии Vero E6. По результатам нашего запроса транскриптомов hKEpC и kSPH до инфекции и сравнения с клетками Vero E6 в первых обнаружились высокие исходные уровни молекул, связанных с ответом интерферона 1 типа. Эксперты предполагают, что ответ интерферона 1 типа служит клеточным средством борьбы с вирус-индуцированной цитопатией. Это означает, что на основании данного наблюдения можно установить исходный уровень ответа на цитопатический эффект/повреждение клеток в культурах человеческой почки после инфекции. В совокупности полученные данные, свидетельствующие об отсутствии выраженных клеточных эффектов, соответствуют клинической информации о первых 36 пациентах, лечившихся в отделении реанимации, и позволяют предположить, что ОПП развивается под воздействием вторичных этиологических факторов.

Необходимо провести дальнейшую работу для того, чтобы определить причину отсутствия цитопатического поражения даже при явной инфекции и репликации SARS-CoV-2 в клетках человеческой почки. Примечательно, что схожие уровни вирусных титров доказанно вызывают значительный цитопатический эффект в других органах, включая сердце, хотя успешное инфицирование органоидов человеческого легкого, воспроизводящих первичный очаг вирусной инфекции, не вызывает цитопатический эффект ни in vitro, ни in vivo. Как уже упоминалось, возможным объяснением может выступать более явная и более эффективная активация антивирусных клеточных путей – например, сигнального пути интерферона, предположительно обладающего сильным действием против SARS-CoV-2.

Вместе с тем по результатам анализа молекул повреждения STAT6, COL1A1 и SNAI2, индуцированных ОПП, после вирусной инфекции обнаружилось значительное повышение их уровней, в то время как уровни LRP2 снизились, указывая на то, что после инфицирования и репликации вируса в клетках могут происходить менее явные повреждения. Эти изменения оказались особенно заметными в культурах человеческих клеток почечного эпителия. Примечательно, что по результатам детального сравнения почечных сфероидов и монослоев обнаружилось, что последние поддерживают более высокую инфекционность/репликацию и более выраженное повышение уровней молекул, ассоциированных с инфекцией SARS-CoV-2, включая IRF7, USP18 и CCL5.

Почечные сфероиды и hKEpC представляют собой две противоположные стороны спектра. Для диссоциированной ткани человеческой почки, выращенной в питательной среде в виде монослоя, характерны те же явления, что и для ОПП, а именно потеря латентности, пролиферация и частичная дедифференциация.

И напротив: почечные сфероиды больше соответствуют клеточному составу почечных тубулярных компартментов, что уже отмечалось по итогам транскриптомного и белкового анализа. Как и нативная почка взрослого человека, почечные сфероиды состоят из медленно обновляющихся эпителиальных клеток. Даже несмотря на то, что они экспрессируют высокие уровни молекул, связанных с проникновением вируса в клетки, и поддерживают инфекцию и репликацию, мы не обнаружили очевидных признаков существенного повышения уровней молекул повреждения почек, связанных с ОПП. Таким образом, дихотомия между моделями культур указывает на возможный сценарий, при котором вирусная инфекция не представляет существенной непосредственной угрозы для почечных канальцев. Тем не менее, после ОПП-индуцированной пролиферации клеток, вызванной вторичными этиологическими факторами, инфекция и репликация вируса усиливают повреждения, вызывая дальнейшую дедифференциацию, потерю клеточной идентичности и профиброзное состояние.

И наконец, возможность генерировать подобные культуры из мочи позволит нам применять данный подход в рамках персонализированной и прецизионной медицины, путем культивирования собственных клеток пациента неинвазивным способом. Данная техника предположительно позволит ответить на ряд наиболее актуальных вопросов, касающихся поражения почек при COVID-19 с учетом возраста, пола, этнической принадлежности и т.п.

Другие актуальные исследования:

Дата публикации: 19.06.2021
Работаем без выходных: 24/7
Обслуживание на трех языках: иврит, русский и английский
Введите ваши данные и врач клиники перезвонит вам в течение часа
Whatsapp
с врачом клиники 24/7
×
×
×
×