Прорыв в области тканевой инженерии от израильских учёных: создание мышечной ткани с лимфатической сетью

Израильские учёные создали мышечную ткань с лимфатической сетью

Исследователи из факультета биомедицинской инженерии университета Технион в Хайфе смогли создать мышечную ткань, которая содержит лимфатическую сеть. Посвященное такому прорыву исследование под названием «Изучение лимфангиогенеза in vitro и in vivo с применением тканеинженерных сетей человеческих лимфатических сосудов» было недавно опубликовано в журнале Американской академии наук PNAS.

Авторы исследования: Шира Шандау, Абигейл Ньюмен, Шломит Эдри, Инбаль Михаэль, Шахар Бен-Шаул, Юлия Шандалов, Том Бен-Арье (факультет биомедицинской инженерии, университет Технион, Израиль), Притиндер Каур (Школа биомедицинский наук, университет Кертин, Австралия), Минг Х. Зенг (Исследовательский институт неврологической и трансляционных наук Перрона, Австралия), Шуламит Левенберг (факультет биомедицинской инженерии, университет Технион, Израиль).

Введение

Лимфатическая система участвует в различных биологических процессах, включая выведение жидкости из интерстиция в венозную систему, абсорбцию липидов и миграцию иммунных клеток. Невзирая на его важную роль в гомеостазе, лимфангиогенез (образование лимфатических сосудов) изучается не так обширно, как родственный процесс – ангиогенез (образование кровеносных сосудов). Несмотря на то, что внедрение сети лимфатических сосудов в сконструированные ткани или органоиды обеспечило бы более точную мимикрию под нативную ткань, создание инженерной ткани, содержащей лимфатические сосуды, рассматривается лишь в некоторых исследованиях.

В данной работе мы населили толстые пластины коллагена клетками человеческого лимфатического эндотелия, соединили их с поддерживающими клетками и клетками эндотелия кровеносных сосудов и изучили лимфангиогенез внутри итоговых конструкций. Нашей модели потребовалось всего лишь несколько дней для того, чтобы развить функциональную сеть лимфатических сосудов. Это отличает ее от других описанных моделей, в которых данный процесс занимал несколько недель.

Выяснилось, что для лимфангиогенеза необходима кокультивация клеток лимфатического эндотелия с соответствующими поддерживающими клетками и сигналы интактного PDGFR-β. Кроме того, воздействие на конструкции циклическим натяжением позволило создать комплексную мышечную ткань вдоль сетей лимфатических и кровеносных сосудов и тем самым обеспечить более точную биомимикрию под нативную ткань. Примечательно, что реакция развивающихся лимфатических сосудов на растяжение отличалась от реакции кровеносных сосудов; в то время как кровеносные сосуды располагались перпендикулярно направлению растяжения, лимфатические сосуды в основном располагались параллельно направлению растяжения.

Имплантация тканеинженерных лимфатических конструкций в мышечную ткань мышиной брюшной стенки привела к анастомозу между лимфатическими сосудами хозяина и имплантата, что демонстрирует потенциальную функциональность тканеинженерной конструкции in vivo. В целом, данная модель представляет собой потенциальную платформу для изучения лимфангиогенеза и механизмов заболеваний, поражающих лимфатическую систему.

Системы лимфатических и кровеносных сосудов – это две отдельные сосудистые сети. Их синхронная работа обеспечивает сохранение тканевого гомеостаза. Кровеносные сосуды разносят по телу кислород и питательные вещества, в то время как лимфатические сосуды забирают выделяющуюся жидкость и макромолекулы из интерстициального пространства и возвращают их в систему кровообращения, поддерживая тем самым гомеостаз интерстициальной жидкости. Более того: лимфатическая система играет главную роль в иммунных реакциях, контроле воспаления и абсорбции липидов.

Хотя исследователи разработали множество моделей in vitro для изучения ангиогенеза, попытки создать платформу in vitro для изучения лимфангиогенеза предпринимались реже. Такие тканеинженерные модели необходимы и для фундаментальных исследований, и для разработки клинически имплантируемой ткани в целях лечения различных заболеваний лимфатической системы. Одним из таких заболеваний является лимфостаз – хроническое нарушение, которым страдает 200 миллионов человек по всему миру. Лимфостаз описывается как опухание ткани в результате поражения лимфатической системы. Несмотря на то, что данное нарушение чаще всего возникает в виде осложнения противораковой терапии, оно также может развиться в связи с генетической патологией. Лимфостаз является прогрессирующим, неизлечимым нарушением, ассоциированным с высоким риском инфекции. Имплантация сконструированной лимфатической ткани может служить средством лечения лимфостаза.

Ток лимфы преимущественно обеспечивается за счет давления, нагнетаемого при лимфатических сокращениях клеток гладкой мускулатуры, окружающих сосуды. Соответственно, уменьшение сократительной способности замедляет ток лимфы и в ряде случаев вызывает лимфостаз. В прошлых исследованиях изучалась взаимосвязь между сократительной способностью лимфатических сосудов и механической стимуляцией, включая механическую нагрузку и перепады давления и величины гемодинамического удара. Более того: эксперты исследовали способность лимфатических сосудов расширяться в условиях механической нагрузки. Известно также, что в обеспечении функциональности лимфатических сосудов важную роль играет состав микросреды.

К данному моменту нескольким группам удалось сконструировать лимфатические ткани. Марино и соавторы разработали дермо-эпидермальные кожные трансплантаты с лимфатическими и кровеносными сосудами в геле фибрина и коллагена. Другие создали сеть лимфатических сосудов с многослойными пластинами фибробластов. В рамках еще одного исследования эксперты продемонстрировали, что для оптимального роста и развития клеток эндотелия кровеносных и лимфатических сосудов (BEC и LEC, соответственно) требуется гидрогель с разными составами. Тем не менее, ни в одном из исследований не изучалось влияние поддерживающих клеток, секретируемого внеклеточного матрикса (ВКМ) и механического воздействия на формирование лимфатических сосудов. Так как лимфатические патологии связаны с механическим повреждением лимфатических сосудов, важно создать лимфатические модели с биомиметической микросредой.

В рамках представленной работы мы сконструировали сети лимфатических сосудов с тем, чтобы рассмотреть фундаментальные проблемы лимфангиогенеза, включая влияние различных поддерживающих клеток на образование лимфатических сосудов и роль PDGFR-β – важного рецептора, ассоциированного с рекрутментом поддерживающих клеток, – в формировании сосудов. В дополнение мы произвели комплексную ткань, призванную лучше мимикрировать под нативную ткань, и организовали наблюдение за развитием кровеносных и лимфатических сосудов и формированием мышц. Мы также оценили воздействие циклического растяжения на организацию и взаимное расположение тканей лимфатических и кровеносных сосудов и мышц. Наконец, мы организовали мониторинг пенетрации и анастомоза тканеинженерных лимфатических сосудов после их имплантации в организм мыши.

Ход исследования

Стволовые клетки пульпы зуба превосходят другие поддерживающие клетки в индукции образования лимфатических сосудов

Мы произвели посев клеток лимфатического эндотелия вместе с поддерживающими клетками в коллагеновые скаффолды CelGro. В отличие от гелей, предрасположенных к проседанию и разрыву, эти скаффолды являются механически стабильными, обеспечивают легкую имплантацию и предотвращают деформацию сосудов. Как сообщалось ранее, для конструирования лимфатических сосудов необходимы поддерживающие клетки. Это подтверждается конструкциями, в культуре которых отсутствуют поддерживающие клетки: сосуды не образуются, и клетки лимфатического эндотелия остаются одиночными клетками.

Так как в большинстве опубликованных исследований, посвященных тканеинженерным лимфатическим сосудам, в качестве поддерживающих клеток использовались фибробласты, мы изначально культивировали фибробласты с клетками лимфатического эндотелия, имеющими флуоресцентные метки, в пластине CelGro. На второй день после посева по итогам конфокальной визуализации обнаружились признаки развития сосудов. Тем не менее, спустя три дня сосуды деградировали и исчезли. За счет использования перицитов в качестве поддерживающих клеток нам удалось сформировать сеть сосудов из клеток лимфатического эндотелия.

Ранее мы сообщили о том, что стволовые клетки пульпы зуба (DPSCs) способствуют образованию кровеносных сосудов; соответственно, мы изучили и их потенциал в плане поддержки формирования лимфатических сосудов. При кокультивации LECs с DPSCs формируются более длинные и стабильные сосуды, чем при кокультивации с фибробластами или перицитами. Более того: на поверхности конструкций, содержащих фибробласт, возникал слой одиночных клеток, свидетельствующий о неспособности клеток формировать сосуды на этом участке. Сосуды в основном находились внутри скаффолда. Вместе с тем в конструкциях, содержащих DPSCs, такой клеточный слой не возникал, и в образовании сосудов участвовали все клетки лимфатического эндотелия. Соответственно, стволовые клетки пульпы зуба обладают существенным преимуществом над фибробластами в плане поддержки формирования лимфатических сосудов.

Чтобы выявить первопричину этих различий, мы окрасили конструкции с фибробластами и стволовыми клетками пульпы зуба ВКМ-маркерами – коллагеном I и IV типов – и попытались определить, основаны ли данные различия на выработке ВКМ поддерживающими клетками. По результатам конфокальной визуализации мы выявили разницу в экспрессии между конструкциями на поверхности и во внутренних областях. Конструкции с фибробластами оказались покрыты плотной оболочкой из коллагена I и IV типов, в то время как в конструкциях с DPSCs оболочка из коллагена отличалась меньшей плотностью. Во внутренней части конструкций с фибробластами наблюдалась активная экспрессия коллагена I типа, заполнявшего всю конструкцию; коллаген IV типа располагался преимущественно вокруг сосуда.

В конструкциях с DPSCs коллаген обоих типов располагался рядом с формирующимися сосудами. В результате количественного выражения DAPI в районе поверхности обнаружились более высокие концентрации DPSCs. В плотных слоях коллагена внутри конструкций с фибробластами содержались пробелы, указывающие на избыточную нагрузку. Избыточная нагрузка на слои могла привести к неспособности LECs формировать стабильные сосуды внутри этих конструкций.

В целях более подробного описания различий между двумя типами поддерживающих клеток мы произвели окрашивание α-гладкомышечного актина (α-ГМА), свидетельствующего о дифференциации поддерживающих клеток и их рекрутменте для формирования сосудов. Выяснилось, что в конструкциях с DPSCs наблюдается повышенная экспрессия α-ГМА в сравнении с конструкциями, содержащими фибробласты. Более того: в то время как в конструкциях с фибробластами волокна α-ГМА были редкими и располагались между одиночными клетками лимфатического эндотелия, морфология α-ГМА в конструкциях с DPSCs хоть и отличалась удлиненностью, но не обволакивала формирующиеся лимфатические сосуды.

По итогам матричного анализа цитокинов в клеточной среде, собранных на 4 и 7 день после посева клеток, мы выявили более высокую секрецию VEGF-A в конструкциях с DPSCs по сравнению с конструкциями, содержащими фибробласты. Кроме того, в конструкциях с DPSCs на 4 день наблюдалась повышенная экспрессия лептина. Уровни секреции Ang-2 и фактора роста гепатоцитов (HGF) в обеих конструкциях оказались приблизительно одинаковыми на 4 день, однако повысились в конструкциях с фибробластами на 7 день.

Ингибирование VEGF с применением SU5416 привело к тому, что клетки лимфатического эндотелия остались одиночными клетками и практически не сформировали сосудов. Применение антитела к a-ангиогенину привело к образованию меньшего количества сосудов в сравнении с контрольной группой. Применение α-HGFR, в свою очередь, привело к укорочению тех элементов сосудов, которые имели наименьшую связь друг с другом; это видно по большему количеству оконечностей сосудов в сравнении с контрольной группой.

Чтобы лучше понять ту роль, которую DPSCs играют в поддержке образования лимфатических сосудов, мы провели эксперимент с секвенированием РНК (RNA-seq), в рамках которого извлекли РНК из конструкций, засеянных клетками лимфатического эндотелия с DPSCs и без таковых. По результатам анализа генов, имевших существенные различия (скорректированное значение P > 0,05) и кратность изменения около 5, мы обнаружили, что три образца из двух групп образовали кластеры. Анализ обогащенных сигнальных путей ап-регулируемых генов в группе кокультуры позволил выяснить, что наиболее обогащенные сигнальные пути ассоциируются с ВКМ и интегринами. Вместе с тем обогащенные сигнальные пути даун-регулируемых генов ассоциировались с патологическими лимфатическими сосудами и морфологией эндотелиальных клеток. После мы изучили пути обогащения первых 40 генов с наибольшей кратностью изменения; сигнальные пути ассоциировались с сигналами VEGFR3, интегринами и сигналами PDGFR.

Роль PDGFR-β в формировании лимфатических и кровеносных сосудов

В целях дальнейшего изучения роли поддерживающих клеток в формировании лимфатических сосудов мы произвели нокдаун PDGFR-β – ключевого рецептора, ответственного за рекрутмент поддерживающих клеток к формирующимся сосудам. Известно, что лиганд этого рецептора, PDGF-BB, является стимулятором лимфангиогенеза. Мы произвели нокдаун в DPSCs с редактированием по системе CRISPR, опосредованным электропорацией.

По результатам иммуноблоттинга мы выявили снижение белковой экспрессии на ~50% после нокдауна (KD). Как и ожидалось, в контрольных конструкциях DPSC-LEC дикого типа сосуды начали формироваться в первый день и полностью сформировались на 7 день. В конструкциях со стволовыми клетками пульпы зуба PDGFR-β-KD клетки лимфатического эндотелия не смогли образовать стабильную сосудистую сеть; в первый день клетки оставались одиночными и сформировали всего лишь несколько кластеров, а на 7 день клетки образовали короткие и неровные сосуды с немногочисленными ответвлениями. Как и в конструкциях с кокультурой фибробласт-LEC, в конструкциях DPSC-LEC с нокдауном PDGFR-β на поверхности скаффолдов обнаружился монослой одиночных клеток, в то время как сосуды появились только во внутренней части.

В группе нокдауна отмечались разрозненные отложения коллагена I и IV типов. И напротив: в контрольной группе произошла колокализация коллагенов с формирующимися сосудами, потенциально указывающая на то, что нехватка PDGFR-β препятствует образованию базальной мембраны. Кроме того, в DPSCs с нокдауном PDGFR-β обнаружился α-ГМА с аберрантной морфологией. По результатам матричного анализа цитокинов нам удалось выявить более высокую секрецию VEGF, ангиогенина и HGF в контрольной группе на 7 день после посева клеток в сравнении с культурой DPSCs с нокдауном PDGFR-β.

Характеристики и функциональность лимфатических сосудов

Сосудистая сеть, формирующаяся из кокультуры LECs и DPSCs внутри скаффолда CelGro, обладала лимфатическими характеристиками с плотными сосудами, слепыми отростками и просветами. При окрашивании на лимфатический маркер LYVE-1 клетки лимфатического эндотелия дали положительный результат.

Чтобы оценить способность тканеинженерных лимфатических сосудов забирать жидкость из интерстиция, мы ввели в конструкции краситель голубой Эванса. На снимке, полученном по итогам конфокальной визуализации через 10 минут после инкубации, видно, что краситель локализовался внутри тканеинженерных лимфатических сосудов, демонстрируя их способность собирать жидкость из окружающих тканей.

Конструирование комплексной ткани: инкорпорация BECs и LECs

Чтобы усовершенствовать сконструированную ткань и создать более комплексную конструкцию, более точно имитирующую нативную ткань, мы добавили к культуре клетки эндотелия кровеносных сосудов. Такая комбинация клеток образовала отдельные сети кровеносных и лимфатических сосудов. Тем не менее, мы обнаружили несколько соединений между сетями. Сосуды начали формироваться в первый день и полностью сформировались на 7 день. И напротив: в конструкциях DPSC-BEC-LEC с нокдауном PDGFR-β эндотелиальным клеткам обоих типов не удалось сформировать сосудистую сеть; в первый день клетки оставались одиночными, а на 7 день они сформировали кластеры с небольшим числом разветвлений.

По итогам иммунофлуоресцентного окрашивания коллаген I и IV типов обнаружился и вокруг лимфатических, и вокруг кровеносных сосудов в конструкциях DPSC-BEC-LEC; ламинин и α-ГМА в основном удалось выявить внутри клеток, обволакивающих кровеносные, но не лимфатические сосуды. И наконец, в целях создания комплексной мышечной ткани, содержащей и лимфатические, и кровеносные сосуды, мы культивировали LECs, BECs, DPSCs и миобласты в одной конструкции. Окрашивание этих конструкций десмином позволило выявить формирование как мышечных трубочек, так и сетей лимфатических и кровеносных сосудов.

Расположение лимфатических сосудов при циклическом растяжении отличается от расположения кровеносных сосудов, мышечных клеток и поддерживающих клеток в связи с различиями в пространственном размещении

Понимание механотрансдукции в лимфангиогенезе может способствовать пониманию заболеваний, при которых лимфатические сосуды подвергаются аномальной механической нагрузке. Ранее мы продемонстрировали, что BECs формируют кровеносные сосуды, меняющие свое взаимное расположение при циклическом натяжении. Эта смена взаимного расположения опосредуется поддерживающими клетками в культуре; и поддерживающие клетки, и сети кровеносных сосудов располагаются перпендикулярно направлению силы натяжения.

Мы, таким образом, попытались изучить поведение клеток лимфатического эндотелия в условиях циклического натяжения. При кокультивации LECs с DPSCs и циклическом натяжении LECs, расположенные на поверхности конструкции, остались одиночными клетками с незначительным уклоном перпендикулярно направлению силы натяжения. В более глубоких слоях скаффолда обнаружились сети из двух сосудов; один располагался перпендикулярно, а второй – параллельно направлению силы натяжения. Превалировала популяция сосудов, располагающихся параллельно направлению силы натяжения.

После добавления BECs к кокультурам LEC-DPSC BECs повели себя как ожидалось: образовали сосуды, располагающиеся перпендикулярно направлению силы натяжения. LECs, напротив, не образовали сосудов и остались одиночными удлиненными клетками на поверхностных участках. В более глубоких частях скаффолда они сформировали сосуды, преимущественно расположенные параллельно направлению силы натяжения. Лишь несколько сосудов располагались перпендикулярно.

Чтобы усовершенствовать имитацию нативной ткани, которая подвергается естественному натяжению в организме, мы культивировали LECs и BECs со стволовыми клетками пульпы зуба и миобластами. Примечательно, что расположение миобластов походило на расположение эндотелиальных клеток лимфатических и кровеносных сосудов; они размещались перпендикулярно направлению силы натяжения.

Чтобы подробнее изучить биологические процессы, обусловливающие морфологические различия в реакциях клеток на натяжение, мы проанализировали протеомы кокультур LECs с DPSCs и BECs с DPSCs в условиях циклического натяжения методом масс-спектрометрии. Анализ обогащенных сигнальных путей помог выяснить, что значительно ап-регулируемые белки в группе BECs ассоциировались с реакцией на внешний стимул, реакцией на механический стимул, ремоделированием ткани и ВКМ, в то время как в группе LECs ап-регулируемые белки ассоциировались с цитоскелетом, подвижностью клеток, мембранной организацией и клеточной полярностью.

Тканеинженерные лимфатические сосуды интегрируются in vivo и аностомозируют с лимфатическими сосудами хозяина

Чтобы оценить способность тканеинженерных лимфатических сосудов аностомозировать с лимфатическими сосудами хозяина и возможность их применения в качестве средства лечения лимфостаза, мы имплантировали конструкции LEC-DPSC, которые культивировали в течение 7 дней со зрелыми и соответственно расположенными лимфатическими сосудами, мышам с дефектом мышечной ткани в брюшной стенке.

Мы умертвили мышей на 7 день после имплантации и подвергли имплантаты окрашиванию тотальными препаратами. Мышиные лимфатические маркеры (mCD31 и mLYVE1) подтвердили окутывание имплантата и наличие полноценных соединений между лимфатическими сосудами имплантата и хозяина. Имплантация конструкций, подвергшихся циклическому натяжению, привела к инвазии лимфатических сосудов хозяина с размещением по тому же принципу, по которому располагались сосуды имплантата.

Результаты

Сети лимфатических сосудов играют важную роль в различных биологических процессах; соответственно, внедрение таких сетей в тканеинженерные конструкции может иметь значение как для научно-исследовательской, так и для клинической работы. Сконструированные лимфатические сосуды способны улучшить биомимикрию и функциональность образцов ткани in vitro и послужить средством лечения различных заболеваний, ассоциированных с нарушением функций лимфатической системы.

В рамках представленной работы мы создали функциональные тканеинженерные лимфатические сосуды, сообщающиеся с лимфатической системой хозяина после имплантации. Мы исследовали воздействие поддерживающих клеток, секретируемого клетками внеклеточного матрикса и механических сил на формирование лимфатических сосудов внутри тканеинженерных конструкций.

Примечательно, что сеть лимфатических сосудов иначе отреагировала на циклическое растяжение в сравнении с сетью кровеносных сосудов. Данный феномен открывает новые возможности изучения вариабельности клеточного ответа на механическую стимуляцию.

Другие актуальные исследования:

Дата публикации: 09.08.2021