Учёные Тель-Авивского университета разработали продукт, защищающий костную ткань и предотвращающий воспаление

Израильские ученые разработали препарат, защищающий костную ткань и предотвращающий воспаление

Учёные Тель-Авивского университета разработали уникальную молекулу, которая сперва была предназначена для лечения болезни Альцгеймера, а также импотенции. Исследователи выяснили, что она является эффективной и для предотвращения воспаления в зубных и ортопедических имплантатах. Результаты исследования под названием «Терапевтический потенциал вазоактивного интестинального пептида и его производного стеарил-норлейцин-ВИП при остеолизе, индуцированном воспалением» были опубликованы в журнале Frontiers in Pharmacology.

Авторы исследования: Михал Эгер, Тамар Лирон, Сахар Хирам-Баб, Замзам Авида, Элиезер Гилади, Давид Дангур (Тель-Авивский университет), Мати Фридкин (нститут Вейцмана), Давид Кохави, Илана Гозес, Янкель Габет (Тель-Авивский университет).

Введение

Повсеместное применение зубных и ортопедических имплантатов требует особого внимания к иммунному ответу, ведущему к перипростетической потере костной ткани и недостаточности имплантата. В стоматологии периимплантит является недавней, но уже значимой клинической проблемой и основной причиной недостаточности имплантата в долгосрочной перспективе. Периимплантит, вызванный определенными бактериями в полости рта, представляет собой воспалительный процесс, ведущий к резорбции кости (остеолизу) вокруг зубных имплантатов. Если процесс уже начался, он с трудом поддается контролю и часто приводит к потере имплантата. Лечение обычно начинается с попыток сохранить имплантат за счет механической чистки окружающей флоры путем снятия зубных отложений ультразвуком, а также местного и системного применения антибиотиков. Если эти методы не сдерживают деструктивный процесс, имплантат удаляют в ходе хирургической операции.

В дополнение к хорошо изученной микробной этиологии потери костной ткани в области имплантата и периодонта (периимплантита и периодонтита, соответственно) важными триггерами воспаления являются продукты износа и в особенности титановые частицы в области имплантата, которые активируют резорбцию кости. Несмотря на то, что титан является биосовместимым материалом и не вызывает иммунного ответа, в предшествующих докладах указано, что ионы и частицы, отделяющиеся от сплава, могут вызвать иммунную реакцию. Частицы титана и других металлов с поверхности имплантата способны вызвать воспалительный ответ, чрезвычайно схожий с воспалением, вызываемым липополисахаридами (модель бактериальной инфекции) в макрофагах. К таким противовоспалительным цитокинам относятся ИЛ-1β, ИЛ-6 и ФНО-α, которые играют ключевую роль в стимулировании резорбции костной ткани вокруг зубов и имплантатов.

Асептическое расшатывание в связи с отделением частиц входит в число основных причин недостаточности синтетических тазобедренных суставов. Эти частицы скапливаются в среде имплантата и вызывают сильный воспалительный ответ, который в итоге приводит к резорбции костной ткани. Титановые частицы в высоких концентрациях также обнаружились вокруг имплантатов в случаях их недостаточности. Количество частиц постепенно увеличивается и достигает критической концентрации, способной привести к перипростетическому остеолизу и подвергнуть опасности выживаемость имплантата.

Вазоактивный интестинальный пептид – это гидрофильный пептид, состоящий из 28 аминокислот и способный ингибировать как воспаление, так и остеокластогенез. Соответственно, данный пептид является перспективным кандидатом в средства против остеолиза, вызванного воспалением. Он действует как нейрогормон и нейротрансмиттер и участвует в многочисленных физиологических процессах, включая вазодилатацию, бронходилатацию, деление клеток и нейропротекцию.

Производные и конъюгаты ВИП разрабатывались с целью включения липофильного компонента или укороченной цепи ВИП. Стеарил-норлейцин-ВИП (Stearyl-Nle17VIP, СНВ) – это липофильное вещество, состоящее из молекулы ВИП с N-терминальным прикреплением стеариновой кислоты в целях повышения биодоступности клеток и тканей и обмена уязвимого перед окислением метионина в позиции 17 на стабильный норлейцин. Как указано выше, СНВ в 1000 раз мощнее ВИП в отношении нейропротекции и формирования цГМФ с периодом полураспада в 15 минут вместо ~30 секунд. По этим причинам мы тестируем его терапевтический потенциал при воспалении, вызванном остеолизом. Более того: стеариловый липофильный компонент обеспечивает улучшенную проницаемость сквозь кожу; это уже отмечалось и теперь в подробностях продемонстрировано ниже.

Ход исследования

СНВ обладает противовоспалительным эффектом в клеточных культурах

ИЛ-1β, ИЛ-6 и ФНО-α – это основные медиаторы воспаления и остеолиза, опосредованного частицами титана. Иммуномодулирующая роль ВИП хорошо изучена, и вначале мы исследовали действие ВИП и СНВ на экспрессию этих провоспалительных цитокинов в макрофагах. Мы обработали макрофаги, извлеченные из костного мозга, 10-6 моль/л ВИП или СНВ (или контрольного солевого раствора) за 1 час до добавления ЛПС (1 мкг/мл). Контрольные культуры не подвергались обработке (только М-КСФ – макрофагальным колониестимулирующим фактором).

Спустя 24 часа мы извлекли РНК и обнаружили значительное повышение уровней экспрессии трех цитокинов в культурах, обработанных ЛПС, по сравнению с контрольными культурами макрофагов. ВИП продемонстрировал смешанный иммуномодулирующий эффект, снизив ИЛ-1β и повысив ИЛ-6 (–40% и +90%, соответственно, p < 0,05), и никак при этом не повлиял на экспрессию ФНО-α. СНВ не повлиял на уровни экспрессии ИЛ-6 и ФНО-α и значительно снизил уровни экспрессии ИЛ-1β (на 35%, p < 0,05), что можно считать чистым противовоспалительным эффектом.

СНВ подавляет остеокластогенез

Затем мы изучили прямое действие ВИП и СНВ на остеокластогенез. Вначале мы задались вопросом о том, экспрессируются ли в преостеокластах в процессе дифференциации транскрипты, кодирующие VPAC-1 и VPAC-2 – классические рецепторы ВИП и СНВ. Макрофаги из костного мозга, предшественники остеокластов in vitro, культивировались при наличии М-КСФ и RANKL в целях индукции дифференциации остеокластов. И VPAC-1, и VPAC-2 экспрессировались в макрофагах из костного мозга до добавления RANKL (день 0), и уровни экспрессии снизились на 58% и 92%, соответственно, за 2 дня остеокластогенеза. Затем мы изучили действие ВИП и СНВ на дифференциацию остеокластов в отсутствие воспаления. В соответствии с предыдущими докладами, ВИП существенно ингибировал остеокластогенез, что видно по уменьшению числа остеокластов и общей площади. СНВ произвел сравнимый ингибирующий эффект на дифференциацию остеокластов, поэтому различия в действии ВИП и СНВ в данном анализе не отмечено.

Затем мы подвергли макрофаги, полученные из костного мозга, воздействию титановых частиц и, как уже отмечалось, обнаружили значительное повышение уровней ИЛ-1β, ИЛ-6 и ФНО-α, наблюдающееся и при реакции на липополисахариды. Мы также собрали супернатант макрофагов, подвергшихся воздействию частиц титана, и на второй день добавили его к остеокластогенным культурам вместе с ВИП или СНВ. Часть культур мы оставили без обработки. Примечательно, что супернатант макрофагов, подвергшихся воздействию титановых частиц, оказал значимое влияние на остеокластогенез, увеличив площадь остеокластов на 57%. В условиях воспаления обработка ВИП привела к уменьшению площади остеокластов, а СНВ уменьшил и площадь, и количество, продемонстрировав более мощный ингибирующий эффект на остеокласты по сравнению с ВИП. Данный ингибирующий эффект не обусловливался цитотоксичностью, так как за 5 дней обработки ни ВИП, ни СНВ не повлияли на жизнеспособность клеток в культуре.

СНВ биодоступен для кожи

На основе этих наблюдений и результатов прошлых фармакологических экспериментов, указывающих на ограниченные возможности терапевтического применения ВИП в связи с очень коротким периодом полураспада и низкой проницаемостью сквозь липидные барьеры (кожу и эпителий), мы выбрали СНВ в качестве потенциального терапевтического средства для лечения остеолиза, вызванного воспалением. Предпосылкой для такой методики послужила высокая проницаемость сквозь ткани и эпителий.

В дальнейшем мы провели анализ трансэпителиальной проницаемости в крысиной модели. В рамках анализа мы поместили шарик СНВ с радиоактивной меткой во влагалище, и со временем местные уровни СНВ снизились. В это же время уровни СНВ в крови, сердце, легких, печени, кишечнике, матке и почках стабильно росли, что указывает на высокую проницаемость СНВ через эпителий влагалища и дальнейшую стабильность в тканях. Ранее исследователи уже демонстрировали целостность радиоактивного СНВ.

СНВ нетоксичен

Мы также провели несколько токсикологических исследований на кроликах, морских свинках и крысах и получили чистый токсикологический профиль. Исследование 004-1 представляло собой наиболее продолжительное и подробное токсикологическое исследование. Мы провели его на крысах в целях оценки токсичности многократных доз и обрабатывали наружные органы – половой член и влагалище. В структуру эксперимента вошло детальное патологическое исследование всех органов.

Ни одна доза не вызвала макроскопических или микроскопических изменений, связанных с применением препарата. Все изменения, выявленные патологом, учитывались как спонтанные, случайные явления, не менее характерные для крыс того же вида и возраста, входивших в контрольную группу.

СНВ защищает от остеолиза, вызванного частицами титана

Затем мы произвели оценку остеолиза, вызванного частицами титана, при помощи мышиной модели свода черепа. Местный эффект СНВ тестировался через внедрение в мембраны СНВ и частиц титана. Мы предположили, что СНВ проникнет в ткани и остановит воспалительный процесс и остеокластогенез на поверхности свода черепа. В рамках данного эксперимента мы наблюдали тяжелый остеолиз на поверхности свода черепа, под мембраной с частицами титана.

Местное нанесение СНВ привело к существенной супрессии остеолиза, вызванного частицами титана, и снижению объема резорбции, в том числе в процентах к общему объему ткани, на 60%. Существенных различий в толщине свода черепа не обнаружилось. Данное наблюдение подтверждает предположение о том, что СНВ подавляет резорбцию костной ткани, а не стимулирует ее неравномерную аппозицию.

Результаты

В представленной работе мы использовали бактериальные липополисахариды (ЛПС) для моделирования инфекции и титановые частицы для моделирования асептического воспаления и остеолиза. Мы оценили степень воспаления in vitro путем измерения экспрессии мРНК ИЛ-1β, ИЛ-6 и ФНО-α в первичных макрофагах, остеокластогенеза в RANKL-индуцированных преостеокластах костного мозга и остеолиза in vivo в мышиной модели свода черепа. Мы также изучили трансэпителиальную проницаемость и безопасность тестируемого вещества для крыс.

По результатам работы видно, что липофильное сверхактивное производное вазоактивного интестинального пептида (ВИП), а именно стеарил-норлейцин-ВИП (СНВ) обладает более эффективным противовоспалительным и антиостеокластогенным действием в сравнении с ВИП in vitro. В модели бактериальной инфекции (ЛПС) СНВ существенно снизил экспрессию ИЛ-1β, в то время как ВИП повысил экспрессию ИЛ-6. В асептических моделях остеолиза СНВ позволил добиться более эффективной супрессии in vitro остеокластогенеза по сравнению с ВИП и значительно ингибировал остеолиз, вызванный воспалением, in vivo.

По нашим наблюдениям, уровни экспрессии ВИП-рецептора VPAC-2 (но не VPAC-1) существенно снизились во время дифференциации остеокластов. Важно отметить, что СНВ с уже доказанной ранее повышенной стабильностью по сравнению с ВИП продемонстрировал в рамках данной работы значительную трансэпителиальную проницаемость и чистый токсикологический профиль, став кандидатом в лекарственные препараты. Такой препарат можно применять местно при разрушении кости, которое может как носить асептический характер, так и выступать следствием инфекции.

Как указано выше, остеолиз, вызванный воспалением, – это частое патологическое следствие различных нарушений, включая периодонтит, периимплантит полости рта и расшатывание ортопедических имплантатов. В данном исследовании мы при помощи анализов in vitro продемонстрировали, что СНВ блокирует два общих знаменателя, ведущих к остеолизу, – то есть, воспаление и остеокластогенез, – вне зависимости от того, какую природу имеет воспаление: бактериальную (ЛПС) или асептическую (частицы титана). Таким образом, мы ясно продемонстрировали, что СНВ обладает большим терапевтическим потенциалом по сравнению с ВИП. И при периимплантите полости рта, и при ортопедическом перипростетическом остеолизе макрофаги способствуют воспалительной реакции и секреции проостеокластогенных сигналов.

В будущих работах было бы интересно протестировать терапевтический эффект СНВ в десневых фибробластах и клетках периодонтальных связок, которые также способствуют воспалению и потере костной ткани вокруг зубных имплантатов. Очевидно, наши наблюдения на основе моделей in vitro и in vivo также требуют более углубленного исследования с применением различных бактериальных штаммов, известных своим разрушительным воздействием на костную ткань, в разных анатомических областях (например, в челюсти, бедре), а также в человеческих клетках с валидацией в плацебо-контролируемых двойных слепых рандомизированных клинических испытаниях.

Данное исследование впервые приписывает СНВ терапевтический потенциал в лечении остеолиза, вызванного воспалением. Высокая проницаемость и низкая системная токсичность делают СНВ приемлемым кандидатом в препараты для местного применения. В наших прошлых исследованиях обнаружилась тесная связь между воспалительным ответом, вызванным частицами титана, и аналогичной реакцией на ЛПС. Это значит, что применение СНВ представляет собой перспективный терапевтический подход к проблеме перипростетической и периодонтической потери костной ткани, вызванной продуктами износа и бактериальной инфекцией.

Другие актуальные исследования:

Дата публикации: 08.05.2021